一種檢測(cè)海洋環(huán)境擬桿菌群落的基因芯片及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)海洋環(huán)境擬桿菌群落的基因芯 片及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 國(guó)家海洋經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展引發(fā)海洋環(huán)境安全問題，海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)是保護(hù)海洋生態(tài)環(huán) 境可持續(xù)健康發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)包括化學(xué)監(jiān)測(cè)和生物監(jiān)測(cè)。生物監(jiān)測(cè)主要是 對(duì)海洋環(huán)境中的浮游生物、底棲生物、潮間帶生物、游泳動(dòng)物、大腸桿菌等生物種類組成和 數(shù)量分布進(jìn)行監(jiān)測(cè)，缺少對(duì)海洋細(xì)菌群落的監(jiān)測(cè)。微生物群落在海洋生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重 要的作用，參與物質(zhì)和能量循環(huán)。細(xì)菌作為一類多樣性最高的生命形式，在海洋環(huán)境中承擔(dān) 著重要的生態(tài)功能（碳循環(huán)，氮循環(huán)，硫循環(huán)，磷循環(huán)和金屬循環(huán)等）。細(xì)菌復(fù)雜的群落結(jié) 構(gòu)、功能、相互作用和動(dòng)態(tài)變化對(duì)海洋生態(tài)功能的維持有著重要意義。微生物群落對(duì)環(huán)境變 化響應(yīng)快速，對(duì)污染具有指示作用。因此，增加對(duì)海洋環(huán)境各個(gè)細(xì)菌種類組成和數(shù)量分布的 監(jiān)測(cè)，對(duì)建立、健全近岸海域海洋環(huán)境質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)體系來說十分必要。
[0003] 目前針對(duì)海洋大腸桿菌的監(jiān)測(cè)主要是利用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法。這種監(jiān)測(cè)方法繁 瑣、耗時(shí)、耗力，不適合對(duì)多種細(xì)菌同時(shí)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。亟需發(fā)展高通量、高效、便捷的海洋細(xì)菌 群落監(jiān)測(cè)技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測(cè)海洋環(huán)境擬桿菌群落的基因芯片及 應(yīng)用，即可平行、快速、高通量的檢測(cè)海洋環(huán)境擬桿菌群落，使基因芯片技術(shù)更好的應(yīng)用于 海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)，以彌補(bǔ)現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的不足。
[0005] 本發(fā)明的基因芯片，包括有芯片載體，以及固定在芯片載體上的，用于檢測(cè)海水中 的 Saprospiraceae 菌、Sphingobacteriaceae 菌、Rhodothermacea 菌、Prevotellaceae 菌、 Cryomorphaceae 菌、Porphyromonadaceae 菌、Cytophagaceae 菌、Flavobacteriaceae 菌、 Marinilabiacea 菌、Flammeovirgaceae 菌、Cyclobacteriaceae 菌、Chitinophagaceae 菌、 Bacteroidaceae 菌的探針；
[0006] 其中用于檢測(cè)Saprospiraceae菌的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID NO: 1-3中 的任一種或幾種；
[0007] 其中用于檢測(cè)Sphingobacteriaceae菌的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID NO:4-5中的任一種或幾種；
[0008] 其中用于檢測(cè)Rhodothermacea菌的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID N0:6_7中 的任一種或幾種；
[0009] 其中用于檢測(cè)Prevotellaceae菌的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID NO:8-9中 的任一種或幾種；
[0010] 其中用于檢測(cè)Cryomorphaceae菌的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID NO: 10-11 中的任一種或幾種；
[0011] 其中用于檢測(cè)Porphyromonadaceae菌的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID NO: 12-14中的任一種或幾種；
[0012] 其中用于檢測(cè)Cytophagaceae菌的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID NO: 15-17 中的任一種或幾種；
[0013] 其中用于檢測(cè)Flavobacteriaceae菌的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID NO: 18-20中的任一種或幾種；
[0014] 其中用于檢測(cè)Marinilabiaceae菌的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID N0:21-22 中的任一種或幾種；
[0015] 其中用于檢測(cè)Flammeovirgaceae菌的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID NO:23-24中的任一種或幾種；
[0016] 其中用于檢測(cè)Cyclobacteriaceae菌的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID NO:25-27中的任一種或幾種；
[0017] 其中用于檢測(cè)Chitinophagaceae菌的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID NO:28-29中的任一種或幾種；
[0018] 其中用于檢測(cè)Bacteroidaceae菌的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID NO:30-32 中的任一種或幾種；
[0019] 在本發(fā)明的基因芯片上還固定有雜交陽性對(duì)照質(zhì)控探針、雜交陰性對(duì)照質(zhì)控探 針、表面化學(xué)質(zhì)控探針中的任一種或幾種，
[0020] 雜交陽性對(duì)照質(zhì)控探針（PC)的核苷酸序列為SEQ ID NO:33 ;
[0021] 雜交陰性對(duì)照質(zhì)控探針（NC)的核苷酸序列為SEQ ID NO:34 ;
[0022] 表面化學(xué)質(zhì)控探針（CK)的核苷酸序列為SEQ ID NO: 35,是一條用HEX染料標(biāo)記的 40個(gè)T的寡核苷酸序列。這些熒光探針點(diǎn)的位置可作為芯片上DNA微陣列坐標(biāo)，在芯片檢 測(cè)過程中起到定位探針位置的作用。
[0023] 本發(fā)明芯片所使用的探針可以快速、高通量地對(duì)海水中的擬桿菌群落進(jìn)行檢測(cè)， 最大可以檢測(cè)13個(gè)科的擬桿菌信息，從而為海洋環(huán)境細(xì)菌群落的監(jiān)測(cè)提供了有力的技術(shù) 支持，為建立、健全近岸海域海洋環(huán)境質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)體系奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0024] 圖1 :本發(fā)明基因芯片的探針布局示意圖。
[0025] 圖2 :本發(fā)明基因芯片的特異性檢測(cè)。
[0026] 圖3 :本發(fā)明基因芯片的應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述，下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn) 方法，通?？砂闯Ｒ?guī)條件，如J.薩姆布魯克（Sambrook)等編寫的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中 所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運(yùn)行。
[0028] 實(shí)施例1 :擬桿菌群落檢測(cè)基因芯片的探針設(shè)計(jì)
[0029] 采用高通量測(cè)序技術(shù)和克隆文庫技術(shù)獲得東海海水中擬桿菌群落信息。根 據(jù)擬桿菌群落16S rRNA基因序列信息，利用ARB軟件對(duì)東海海水中13個(gè)主要的擬桿 菌科（Saprospiraceae、Sphingobacteriaceae、Rhodothermacea、Prevotellaceae、 Cryomorphaceae、 Porphyromonadaceae、 Cytophagaceae、 Flavobacteriaceae、 Marinilabiacea、 Flammeovirgaceae、 Cyclobacteriaceae、 Chitinophagaceae、 Bacteroidaceae)進(jìn)行探針設(shè)計(jì)，并在BLAST中進(jìn)行驗(yàn)證，獲得用來制備基因芯片的探針序 列。
[0030] 申請(qǐng)人從檢測(cè)特異性的角度出發(fā)，對(duì)上述可能作為探針的序列進(jìn)行篩選，最終確 定了如下的探針序列：
[0031] 用于檢測(cè)Saprospiraceae微生物的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID NO: 1-3中 的任一種或幾種；
[0032] 其中用于檢測(cè)Sphingobacteriaceae微生物的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID NO:4-5中的任一種或幾種；
[0033] 其中用于檢測(cè)Rhodothermacea微生物的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID NO:6-7中的任一種或幾種；
[0034] 其中用于檢測(cè)Prevotellaceae微生物的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID NO:8-9中的任一種或幾種；
[0035] 其中用于檢測(cè)Cryomorphaceae微生物的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID NO: 10-11中的任一種或幾種；
[0036] 其中用于檢測(cè)Porphyromonadaceae微生物的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID NO: 12-14中的任一種或幾種；
[0037] 其中用于檢測(cè)Cytophagaceae微生物的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID NO: 15-17中的任一種或幾種；
[0038] 其中用于檢測(cè)Flavobacteriaceae微生物的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID NO: 18-20中的任一種或幾種；
[0039] 其中用于檢測(cè)Marinilabiaceae微生物的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID NO:21-22中的任一種或幾種；
[0040] 其中用于檢測(cè)Marinilabiaceae微生物的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID NO:21-22中的任一種或幾種；
[0041] 其中用于檢測(cè)Flammeovirgaceae微生物的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID NO:23-24中的任一種或幾種；
[0042] 其中用于檢測(cè)Cyclobacteriaceae微生物的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID NO:25-27中的任一種或幾種；
[0043] 其中用于檢測(cè)Chitinophagaceae微生物的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID NO:28-29中的任一種或幾種；
[0044] 其中用于檢測(cè)Bacteroidaceae微生物的核酸探針，其核苷酸序列為SEQ ID NO:30-32中的任一種或幾種；
[0045] 還有點(diǎn)制在芯片上的：
[0046] 雜交陽性對(duì)照質(zhì)控探針（PC)，采用的是細(xì)菌16S rRNA基因的保守性片段。其主要 功能是與PCR擴(kuò)增過程中