改進(jìn)的ngs工作流程的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及核酸序列分析領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及關(guān)于下一代測序（NGS)的方 法和工具。DNA測序是一種用于破譯一些人類疾?。ㄋ黾膊“婕鞍┌Y的形成的不同 類型的基因）的有力方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 下一代測序（NGS)技術(shù)的出現(xiàn)成數(shù)量級地降低了測序成本并且顯著地增加了通 量，從而使全基因組測序成為用于獲得關(guān)于可被采取臨床措施的患者的整體基因組信息的 可行方式。DNA測序可被用于確定個別基因、較大基因區(qū)域（即，基因或操縱子的簇）、全部 染色體或整個基因組的序列。取決于使用的方法，測序可以提供DNA中或從動物、植物、細(xì) 菌等的細(xì)胞或者實際上任何其他基因信息源分離的核苷酸的序列。得到的序列可被分子生 物學(xué)或遺傳學(xué)的研究者使用，并且可被用于進(jìn)一步的科學(xué)進(jìn)程，或者可被醫(yī)務(wù)人員用來做 出治療決策或幫助基因咨詢。后兩種用途經(jīng)常在具有個體化治療或伴隨診斷應(yīng)用的背景中 引用。
[0003] 無論NGS技術(shù)提供多大的利益，在NGS技術(shù)可以從研究工具變成常規(guī)臨床實踐之 前必須充分解決一些挑戰(zhàn)。為了診斷目的的NGS技術(shù)應(yīng)當(dāng)需要盡可能少的手動步驟，包括 適當(dāng)機制以防止被源于臨床樣品（所述臨床樣品在給定時間點進(jìn)行分析）之外的其他來 源的核酸材料污染，并且所述方法應(yīng)當(dāng)快速并且應(yīng)當(dāng)被在臨床實驗室工作的人員容易地執(zhí) 行。
[0004] 已經(jīng)發(fā)展了不同NGS技術(shù)，其涉及多種物理-化學(xué)機制，導(dǎo)致相應(yīng)核酸序列分析中 使用不同方法。這些技術(shù)在本技術(shù)領(lǐng)域中通常是已知的。最廣泛應(yīng)用的技術(shù)是離子半導(dǎo)體 (Ion Torrent)測序、焦磷酸測序和合成測序（Illumina)0
[0005] 已經(jīng)一般性描述了本發(fā)明的方法，將更詳細(xì)地描述所述方法的每個方面。
[0006] 如本文使用的，被測序的核酸稱為目標(biāo)核酸（或目標(biāo)）。目標(biāo)核酸包括但不限于 DNA(例如但不限于基因組DNA、線粒體DNA、cDNA等）和RNA(例如但不限于mRNA、miRNA)， 等。目標(biāo)核酸可來源于任何來源（包括天然存在的來源或合成來源）。核酸可以是PCR產(chǎn) 物、粘粒、質(zhì)體、天然存在或者合成庫的成員或種類等。本發(fā)明不意在限于此點。核酸可以 來自動物或病原體來源，包括但不限于哺乳動物（例如人）和微生物（例如細(xì)菌、病毒、真 菌、寄生物和分枝桿菌）。在某些實施方式中，核酸不是病毒核酸。目標(biāo)核酸可以從任何體 液或組織（包括但不限于血液、唾液、腦脊髓液（"CSF"）、皮膚、毛發(fā)、尿液、大便和粘液） 獲得。目標(biāo)核酸可還來源于但不限于，環(huán)境樣品（例如水的樣品）、食品樣品、或法醫(yī)樣品， 所述樣品可以是新鮮樣品（例如，直接進(jìn)行核酸提取的活檢材料）或者已被處理以便允許 存儲的樣品（例如，被福爾馬林固定的和/或石蠟包埋的樣品（FFPE樣品））。
[0007] 使用本領(lǐng)域中任何已知方式來制備目標(biāo)核酸。作為實例，可以根據(jù)本領(lǐng)域中公知 的技術(shù)（見例如Sambrook等的'Maniatis'）從樣品來獲得基因組DNA。在獲得之后，DNA 可以被片段化以便生成具有較短長度的核酸。形成的片段可具有數(shù)百、數(shù)千或數(shù)萬個核苷 酸的長度數(shù)量級。在某些實施方式中，片段具有50-1000個核苷酸長度、100-1000個核苷酸 長度、200-1000個堿基對長度或300-800個堿基對長度，而它們并不限于這些長度。核酸可 以通過任何方式片段化，包括但不限于機械、酶促或化學(xué)方式。實例包括剪切、超聲處理、霧 化和核酸內(nèi)切酶（例如，脫氧核糖核酸酶I)消化或者本領(lǐng)域中已知的任何其他技術(shù)，以便 產(chǎn)生核酸片段（優(yōu)選地具有期望長度的片段）。片段化之后可以是大小選擇技術(shù)，用于將具 體長度的片段富集或分離。這種技術(shù)在本領(lǐng)域中也是已知的，并且包括但不限于凝膠電泳 或 SPRI。
[0008] 可選地，可以使用已經(jīng)具有期望長度的目標(biāo)核酸。這種目標(biāo)核酸包括來源于外顯 子富集方法的那些核酸，對于在測序之前分離和/或富集序列（例如外顯子）的方法，參見 Albert 等 Nat Meth 4(11) :903-905 (2007)、Porreca 等 Nat Meth 4(11) :931-936(2007)、 Okou等Nat Meth 4(11) :907-909(2007)。因此，除了片段化（隨機地或非隨機地）較長的 目標(biāo)核酸，目標(biāo)可以是天然存在的或可被以較短的可用長度分離的核酸，例如mRNA、cDNA、 外顯子、PCR產(chǎn)物（如上面描述的）等。
[0009] 通常，目標(biāo)核酸在5'和3'端中的一端或兩端連到序列。這些接頭序列包括測序 引物位點（即，測序引物將雜交到的位點），所述測序引物位點將被用于本發(fā)明的測序方法 中。
[0010] 在某些實施方式中，如下面論述的，進(jìn)行擴增的目標(biāo)具有相同或類似長度（例如， 目標(biāo)之間5-10%的變化）。在某些實施方式中，這種變化可以保持得盡可能小，以便確保均 勻地施加所有模板。
[0011] 擴增的產(chǎn)物能夠以多種方式固定到支持物表面（例如，玻璃表面）。例如，擴增方 法可以在溶液中執(zhí)行并且最終產(chǎn)品隨后連接到支持物表面。擴增產(chǎn)品可以在其5'端或其 3'端連接到支持物固體支持物?？梢酝ㄟ^雜交連接到核酸（所述核酸被固定到支持物表 面），或者可以通過擴增產(chǎn)品的末端的部分的相互作用與支持物表面上的部分連接。實例包 括：使用生物素或雙生物素標(biāo)記的DNA(Margulies等Nature 437:376(2005))與鏈霉親和 素/抗生物素蛋白/中性抗生物素蛋白包被的支持物表面、DIG (地高辛）和抗DIG抗體或 抗體片段、熒光素和抗熒光素抗體或抗體片段（Gore等Nature 442, 836-9 (2006))，或者通 過使用雜官能交聯(lián)劑，例如生物素化琥珀酰亞胺基丙酸酯-PEG，所述雜官能交聯(lián)劑可被例 如偶聯(lián)到胺官能化玻璃并且用于通過鏈霉親和素夾心（即，核酸生物素鏈霉親和素/抗生 素蛋白/中性抗生素蛋白-生物素固體支持物相互作用）來固定化生物素標(biāo)記的DNA。
[0012] 模板可被提及為隨機固定到表面上。這意味著模板不是基于序列置于固體支持物 表面上。然而，它們以確保每個模板都被一個區(qū)域（并且因此所述體積）環(huán)繞的方式置于 固體支持物上，在聚合酶介導(dǎo)的摻入反應(yīng)和/或在模板的延伸期間所述區(qū)域?qū)⒉粫涣硪?個模板占據(jù)。也就是說，在一些情況下，模板彼此以足夠距離定位在表面上以便防止模板之 間的任何相互作用。
[0013] 固體支持物是指模板結(jié)合或固定的元件，其可包括任意材料，然而，只要所述材料 對于模板、引物、聚合酶、dNTP和在測序反應(yīng)和清洗中使用的其他組分來說相對惰性，所述 材料包括但不限于玻璃或其他硅基材料、塑料或其他聚合物基材料。固體支持物可以是或 者可以不是剛性的。它可以是多孔的。它可以是或者可以不是連續(xù)的。在某些實施方式中， 固體支持物是載玻片。在某些實施方式中，支持物是自身固定到固體支持物上的多個珠子 或顆粒（例如微粒）。這種珠子可以是多孔的。支持物可以是篩網(wǎng)。在某些實施方式中，固 體支持物本身是探測器或傳感器，例如但不限于接觸成像器。
[0014] 應(yīng)當(dāng)理解的是，只要多個成員中的每個都與其他成員充分地間隔開以使得模板之 間沒有發(fā)生重疊，那么多個模板（無論相同或者不同）可被拴連到固體支持物。
[0015] 通常，模板必須在其自由末端連接到可觀察（或可檢測）的部分。這種部分意在 代表模板的自由末端，并且因此其位置和沿著力的方向上的移動指示模板的長度。可觀察 部分可以是任何數(shù)量的部分并且本發(fā)明不限于其性質(zhì)?？捎^察部分的性質(zhì)將決定適于觀察 (或者檢測或監(jiān)測）模板長度的傳感器或檢測器的類型。在某些重要實施方式中，可觀察部 分是珠，例如微珠并且甚至更具體地例如磁珠。
[0016] 部分可以通過多種方法連接到模板，并且采用多種相互作用，包括但不限于非共 價相互作用，例如生物素/鏈霉親和素、DIG/抗DIG和熒光素/抗熒光素結(jié)合對以及共價 相互作用，例如本文關(guān)于模板（或引物）共價固定到支持物表面所討論的那些。
[0017] 固體支持物是流通池的一部分或者鄰近流通池。如本文使用的，流通池是腔室，所 述腔室具有流體流動通過的至少一個進(jìn)入端口和至少一個排出端口。取決于用于觀察模板 的檢測系統(tǒng)的位置，模板拴連到其上的固體支持物可以在流通池下方、上方或旁邊。固體支 持物可以是流通池的壁，包括底部壁、側(cè)壁或頂壁。
[0018] 應(yīng)當(dāng)理解的是，模板的準(zhǔn)確和快速測序取決于未摻入的核苷酸從系統(tǒng)去除的程度 和速率。因此，快速和完全（或幾乎完全）去除未摻入的核苷酸是重要的。微流體系統(tǒng)必 須還被設(shè)計成使清洗最大化，從而潛在地導(dǎo)致更小的清洗體積和清洗持續(xù)時間。
[0019] 還可通過三磷酸腺苷雙磷酸酶部分或完全的使用來促進(jìn)未摻入的核苷酸的清除， 所述三磷酸腺苷雙磷酸酶降解未摻入的dNTP并且使它們不適于進(jìn)一步的摻入。三磷酸腺 苷雙磷酸酶可以自由流動，添加到清洗緩沖液，并且一旦任何給定核苷酸三磷酸鹽類型的 摻入（如通過可檢測部分在模板的端部處的任何上述背景運動的中斷所指示）停止就導(dǎo)入 流通池中。可選地或另外地，三磷酸腺苷雙磷酸酶可以固定或固定化在流通池內(nèi)，例如固定 或固定化到固體支持物表面（模板也固定或固定化到所述固體支持物表面）。這可以通過 使用接頭形成，以便使酶更易獲取并且去除關(guān)于非常接近表面的任何位阻。三磷酸腺苷雙 磷酸酶可以連接到長度不同的多種接頭。以此方式，三磷酸腺苷雙磷酸酶可以存在于流通 池內(nèi)的多種流動流中，所述多種流動流包括那些更接近于壁的流動流和那些更接近于或位 于中心流動流的流動流。如上面論述的，接近壁的流動流（它低速流動）和在這些流動流 中存在的未摻入dNTP不大可能被清除。這些流動流中具有三磷酸腺苷雙磷酸酶應(yīng)當(dāng)改善 這些dNTP的去除。這將增加模板長度改變是新引入到流通池中的dNTP(而非在清洗之后 剩余在流通池中的殘留和未摻入的dNTP)摻入的結(jié)果的可能性。
[0020] 在本發(fā)明的某些方面中，測序方法被稱為合成測序反應(yīng)。這意味著，確定第一核酸 的序列需要使用第一核酸作為模板來合成第二核酸。以此方式，通過未摻入dNTP的順序和 數(shù)量確定第二核酸的序列，并且第一核酸的序列確定為第一核酸序列的互補序列。本發(fā)明 的方法通過改變模板的長度而不是通過直接觀察dNTP添加到