一種從臍帶和胎盤羊膜組織同時提取上皮細胞和間充質(zhì)干細胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種從臍帶和胎盤羊膜組織同時提取上皮細胞和間充質(zhì)干細胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]臍帶和胎盤同屬于胚胎周圍組織，臍帶組織是間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stemcellS，MSCS)的來源。胎盤由胎盤羊膜、絨毛膜和基蛻膜組成。胎盤含有大量的多種干細胞，胎盤羊膜上皮細胞(amn1tic epithelial cells，AECs)具有多種干細胞的特性，其中有一些亞全能干細胞，其特性非常接近胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESCs)。而胎盤間充質(zhì)干細胞則存在于羊膜上皮細胞層之下。羊膜起源于胚胎的上皮層，其發(fā)生早于內(nèi)、中、夕卜三個胚層，因此，胎盤亞全能細胞的分化能力強于起源于其他三個胚層的干細胞。許多實驗證明它們更容易被誘導分化成為機體的各種細胞，因此用于臨床治療的潛能就更大，也就具有更大的市場。相比于臍帶，從胎盤中獲取干細胞的工作還開展的比較少，因此這個研發(fā)項目的意義就更為重大。胎盤絨毛膜也含有大量的間充質(zhì)干細胞和造血干細胞(Hematopoietic stem cells，HSCs);但是因為它的體積很大，不容易取材，所以是利用胎盤組織的最后選擇。
[0003]人間充質(zhì)干細胞(MSC)和上皮干細胞(ESC)移植在治療多種疾病包括治療退行性神經(jīng)病變，新生兒腦缺血和成人腦中風，以及癌癥治療中有廣泛的研究，并且已經(jīng)在多個領(lǐng)域得到臨床應用。
[0004]通過檢索，發(fā)現(xiàn)如下幾篇與本專利申請相關(guān)的專利公開文獻:
[0005]1、人胎盤亞全能干細胞及其干細胞庫構(gòu)建方法(CN103966159A)，提供了一種人胎盤亞全能干細胞，其來源于剝離的人類胎盤羊膜，針對羊膜的上皮層和間充質(zhì)層所含有的細胞特點，采用了逐步分離的方法，最大限度地減少了羊膜間充質(zhì)層細胞對胎盤亞全能細胞的污染，有效地提高了人胎盤亞全能細胞的干性。該發(fā)明還提供了一種從胎盤羊膜制備人胎盤亞全能干細胞并建立干細胞庫的方法，該發(fā)明在剝離人類胎盤羊膜并剪成5 X 5cm組織塊之后，對羊膜的上皮層和間充質(zhì)層采用了逐步分離的方法，首先進行蛋白酶溶液消化，其所用的蛋白酶溶液含有胰蛋白酶，膠原蛋白酶II，和EDTA。然后進一步使用Fico 11淋巴細胞分離液梯度離心，采集兩層液面間的細胞以達到分離培養(yǎng)一種人胎盤亞全能干細胞的目的。
[0006]上述發(fā)明方法的組織分離的步驟比較多，要使用大量的很多種的試劑包括價格昂貴的膠原酶II。
[0007]2、一種人羊膜間充質(zhì)干細胞的分離與鑒定方法(CN104450612A)，公開了一種人羊膜間充質(zhì)干細胞的分離與鑒定方法，采用組織塊貼壁法分離出羊膜間充質(zhì)干細胞并傳代培養(yǎng)，對P1-P3代細胞進行細胞形態(tài)的觀察，用流式細胞儀檢測細胞膜表面陽性分子和陰性分子并采用六孔板法檢測細胞增殖情況，該實驗從胎盤羊膜組織中分離出細胞是hAMSCs，為進一步研究hAMSCs的生物學和免疫學特性、分化能力、核型穩(wěn)定性，以及將其作為臨床應用的種子細胞等提供了基礎。該發(fā)明在剝離人類胎盤羊膜之后，用眼科剪剪成很細小的小塊(約l-2cm)，然后夾取并平鋪于細胞培養(yǎng)瓶中，，使細胞在培養(yǎng)中從組織塊游移出來以實現(xiàn)貼壁生長和增殖。當細胞生長融合成片時，用無菌磷酸緩沖鹽水(PBS)洗去羊膜組織塊。
[0008]上述方法雖然避免了使用大量的試劑包括價格昂貴的膠原酶，但是種植的組織塊還是比較大，不能讓組織內(nèi)的細胞最有效的游移出來。而且手工剪切和鋪放也非常的耗時，用在胎盤羊膜的取材時尚可，但是用在臍帶取材就不實際，因為臍帶組織的量要大得多，而且非常堅硬。
[0009]通過技術(shù)對比，本專利申請與上述兩篇專利公開文獻存在較大的不同。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明目的克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種低成本、簡單快速地從臍帶和胎盤羊膜組織同時提取上皮細胞和間充質(zhì)干細胞的方法。
[0011 ]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
[0012]—種從臍帶和胎盤羊膜組織同時提取上皮細胞和間充質(zhì)干細胞的方法，步驟如下:
[0013]⑴臍帶和胎盤羊膜取材和接種:
[0014]①高溫消毒手術(shù)器械和大玻璃皿，同時紫外線消毒超凈工作臺；
[0015]②配制培養(yǎng)基:完全培養(yǎng)基的組成是:DMEM/F12加完全培養(yǎng)基總體積5%的胎牛血清、完全培養(yǎng)基總體積1%的胰島素、鐵傳遞蛋白和砸的混合添加物，完全培養(yǎng)基中終濃度為20毫微克/毫升的表皮生長因子和完全培養(yǎng)基中終濃度為20毫微克/毫升的堿性纖維母細胞生長因子，無菌過濾，4°C保存；
[0016]所述DMEM/F12中DMEM:F12的體積比為1:1;所述混合添加物及在混合添加物中的終濃度為胰島素5微克/毫升、鐵傳遞蛋白10微克/毫升和亞砸酸鈉5毫微克/毫升；
[0017]③嚴格篩選供者，血液化驗排除傳染??；
[0018]④低溫冰盒中運送臍帶和胎盤:機械剝離胎盤羊膜之后，將臍帶和胎盤羊膜分別置于大玻璃皿中，以下步驟都在無菌條件下進行，將臍帶剪成lcm長的小段，將胎盤羊膜剪成約5X5cm長的方塊，用磷酸緩沖鹽水+總體積1 %的青霉素+總體積1 %的鏈霉素清洗組織兩次，洗干凈臍帶的血液；
[0019]⑤將臍帶和胎盤羊膜組織放在4°C的磷酸緩沖鹽水中，以防止組織在機械剪碎時過熱而影響到細胞存活，使用組織剪碎機來分別破碎成1 _3mm的碎塊，使用低速破碎組織，同時保持細胞活性，得到破碎的臍帶和羊膜組織；
[0020]⑥將破碎的臍帶和羊膜組織分別轉(zhuǎn)移到T175細胞培養(yǎng)瓶中，并用組織刮取器將其平鋪于培養(yǎng)瓶底，小心加入少量完全培養(yǎng)基，使培養(yǎng)液既能覆蓋破碎的臍帶和羊膜組織塊，又不至于使其漂浮起來，置于37°C、飽和濕度5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0021 ]⑵間充質(zhì)干細胞和羊膜上皮細胞在培養(yǎng)瓶中擴增和傳代:
[0022]①培養(yǎng)過程中觀察可見細胞從組織塊逐漸游移出來，并進一步實現(xiàn)貼壁生長和增殖，在培養(yǎng)的第3-4天、當細胞生長融合成片時，用無菌磷酸緩沖鹽水洗去殘存的組織，全部換為新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；
[0023]②此后每4天換一次培養(yǎng)液直到細胞長滿90-100%培養(yǎng)瓶底面積，便進行胰酶消化傳代；
[0024]③胰酶消化傳代:倒棄培養(yǎng)液，用PBS洗細胞2次，每T175用10毫升質(zhì)量百分數(shù)為
0.25%的胰酶-EDTA在37°C消化10分鐘，待細胞懸浮后每個T175加入1毫升胎牛血清以中和胰酶反應，1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，再懸浮于完全培養(yǎng)基中，按1:4細胞數(shù)比例傳代到新T175培養(yǎng)瓶中；
[0025]⑶間充質(zhì)干細胞和羊膜上皮細胞的鑒定:
[0026]①胰酶消化傳到第三代時，用流式細胞儀鑒定培養(yǎng)細胞的純度:
[0027]羊膜上皮細胞的標記物包括:角蛋白CK19，CD29，和⑶34;胎盤和臍帶間充質(zhì)干細胞的標記物包括:⑶73，⑶90，和⑶105 ；
[0028]②流式細胞儀驗證細胞純度達到90%以上，化驗排除常見的傳染病，并排除細菌，支原體污染，即是符合標準，即得上皮細胞和間充質(zhì)干細胞的混合物。
[0029]而且，所述步驟⑴③傳染病為包括艾滋病，甲，乙，丙型肝炎和梅毒；或者，所述步驟⑶②傳染病為包括艾滋病，甲，乙，丙型肝炎和梅毒。
[0030]而且，所述步驟⑴⑤中低速為400-800轉(zhuǎn)/分鐘。
[0031]而且，所述上皮細胞和間充質(zhì)干細胞的混合物的冷凍保存和復蘇方法，步驟如下:
[0032]⑴取上皮細胞和間充質(zhì)干細胞的混合物，用PBS洗兩次以洗掉FBS，0.25%胰酶-EDTA消化，每T175用10毫升，37°C，10分鐘，待細胞懸浮后每個T175加入1毫升FBS以中和胰酶反應。在1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
[0033]⑵再按細胞密度(l-3)X107/ml懸浮于細胞凍存液中，分裝到2ml凍存管中，使用細胞凍存盒在_80°C冰箱緩慢降溫凍存，一天之后轉(zhuǎn)移到液氮罐中長期保存?zhèn)溆茫?br>[0034]所述細胞凍存液組成:總質(zhì)量20 %的DMS0，總質(zhì)量20 %的人血清白蛋白，總質(zhì)量的60%M199培養(yǎng)基；
[0035]⑶使用細胞前，將凍存管中細胞在37°C水浴中迅速解凍，在1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，再懸浮于PBS中，制備成細胞密度為lxl08/ml的細胞懸液以用作包括移植在內(nèi)的實驗和臨床應用，使用之前一直保存在4°C。
[0036]本發(fā)明取得的優(yōu)點和積極效果是:
[0037]本方法成本低、簡單快速，使用組織剪碎機來將臍帶和胎盤羊膜剪碎成極小的碎塊(小于2_3mm)，遠小于目前任何的方法，極為利于直接接種到培養(yǎng)瓶之后細胞向組織外游移，從而實現(xiàn)帖壁生長;不使用任何蛋白酶試劑，從而大幅度地降低成本，減少制備時間，增加產(chǎn)量，使得大規(guī)模細胞制備成為現(xiàn)實;該方法使用添加生長因子及其它營養(yǎng)物的完全細胞培養(yǎng)基，從而降低胎牛血清(FBS)濃度到5%，但是取得與常規(guī)使用10%FBS同級和更佳的培養(yǎng)效果，節(jié)省了血清，但又不像大多數(shù)無血清培養(yǎng)那樣，造成細胞增殖放緩或提早分化。
【具體實施方式】
[0038]下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。
[0039]本發(fā)明中所使用的試劑，如無特殊規(guī)定，均為本領(lǐng)域內(nèi)的常用試劑;本發(fā)明中所使用的方法，如無特殊規(guī)定，均為本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)方法。
[0040]—種從臍帶和胎盤羊膜組織同時提取上皮細胞和間充質(zhì)干細胞的方法，步驟如下:
[0041 ]⑴臍帶和胎盤羊膜取材和接種:
[0042]①高溫消毒手術(shù)器械和大玻璃皿，同時紫外線消毒超凈工作臺；