外周血中分離富集造血干細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬干細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種外周血中分離富集造血干細(xì)胞的方法， 具體說也屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種非骨髓動員的外周血中分離富集造血干細(xì)胞的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，大多數(shù)生物學(xué)家和醫(yī)學(xué)家認(rèn)為，干細(xì)胞是來自于胚胎、胎兒或成體內(nèi)具有在 一定條件下無限制自我更新與增殖分化能力的一類細(xì)胞，能夠產(chǎn)生表現(xiàn)型與基因型和自己 完全相同的子細(xì)胞，也能產(chǎn)生組成機(jī)體組織、器官的已特化的細(xì)胞，同時還能分化為祖細(xì) 胞。
[0003] 造血干細(xì)胞（hematopoieticstemcell,HSC)是具有高度自我更新能力和多向 分化潛能的造血前體細(xì)胞，也是發(fā)現(xiàn)最早、研究最多的一種成體干細(xì)胞，是體內(nèi)各種血細(xì) 胞的惟一來源。哺乳動物造血包含原始造血（primitivehematopoiesis)和永久造血 (definitivehematopoiesis)，而永久造血是由多能的HSC維持的。HSC是具有高度自我更 新能力和多向分化潛能的造血前體細(xì)胞，可形成血液各系的血細(xì)胞，并可重建致死量照射 破壞的造血系統(tǒng)，HSC除可以分化為各系血細(xì)胞外，還可以分化為多種非造血組織的細(xì)胞， 如神經(jīng)細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及多種組織的上皮細(xì)胞等。
[0004] 造血干細(xì)胞在細(xì)胞大小上類似于小淋巴細(xì)胞，細(xì)胞密度一般小于1.066g/ml。因 此，至今仍不能單純從形態(tài)學(xué)上來識別造血干細(xì)胞。而要對HSC進(jìn)行研究，首先必須能把 它從造血組織中分離出來。最常用的方法就是利用HSC表面的標(biāo)志蛋白對其進(jìn)行分離。 目前人的HSC表面標(biāo)志包括CD34+、CD38-、Lin-、Thy-1+、Sca-1+、HLA-DR+、LFA-1+、 ⑶45RA-、⑶71 -、Rhodu11等。⑶34分子是一種跨膜的唾液黏蛋白，相對分子質(zhì)量為115KD， 其編碼基因位于第1號染色體長臂，基因長約26-28kb，含8個外顯子，表達(dá)在造血干細(xì)胞、 一部分造血祖細(xì)胞、小血管內(nèi)皮細(xì)胞及胚胎成纖維細(xì)胞表面，通過篩選CD34+細(xì)胞至少可 以使HSC得到富集，隨著HSC的分化成熟，CD34表達(dá)水平逐漸下降，成熟血細(xì)胞（Lin+)不 表達(dá)⑶34。因而⑶34+為人們普遍認(rèn)同的造血干細(xì)胞及造血祖母細(xì)胞的代表性表面標(biāo)志， 因此本發(fā)明及使用富集CD34+細(xì)胞進(jìn)行體外分離HSC。
[0005]目前HSC提取的主要三種來源為骨髓、動員的外周血和臍帶血。成年人的HSC主 要存在于骨髓，約占骨髓細(xì)胞的〇. 05%，但采用骨髓來源的HSC需要骨髓穿刺會給病人造 成極大的創(chuàng)傷，使其承受極大痛苦，且恢復(fù)時間較長；從動員的外周血中提取則需要動員， 目前動員劑按動員機(jī)制可分為造血生長因子G-CSF、化療藥物和聚陰離子化合物3類，使用 動員劑都會有相關(guān)的毒副作用如造血生長因子近期最常見的副反應(yīng)為骨痛、發(fā)熱、疲乏、頭 痛、失眠、食欲減退、惡心嘔吐、白細(xì)胞過多等而且正常供者使用G-CSF是否增加患白血病 和其他惡性腫瘤的危險性，目前尚不清楚；而臍帶則屬于控制品，獲得材料需要一些控制。 因此三種常規(guī)來源都有一些局限性。
[0006] 也就是說，此三種方式，骨髓取材會造成創(chuàng)傷，病人需要承受極大痛苦；從動員的 外周血中提取，既需要使用動員劑，會存在相關(guān)的副作用；臍帶血來源存在一些方面控制。 因此取材方面三種都存在一定缺陷。而且，非動員的外周血中造血干細(xì)胞的含量少，因而從 非動員的外周血中提取造血干細(xì)胞的數(shù)量、純度不高，不利于后期體外擴(kuò)增培養(yǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的提供一種外周血中分離富集造血干細(xì)胞的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的 不足。二價DNA疫苗技術(shù)來源于普通DNA疫苗，其原理是將針對對蝦白斑病毒兩個重要膜 蛋白功能區(qū)域蛋白基因克隆于同一真核表達(dá)載體中，從而實現(xiàn)針對同一個病原的兩個不同 抗原蛋白的表達(dá)。將這種二價DNA疫苗導(dǎo)入所要免疫的動物體內(nèi)，免疫效果優(yōu)于普通DNA 疫苗及兩種DNA疫苗的聯(lián)合免疫，且更加安全、方便、有效。本發(fā)明將WSSV的VP28、VP19基 因串聯(lián)克隆為融合基因，克隆至Pvaxl.O真核表達(dá)載體，制備多價基因DNA疫苗，可有效的 提高DNA疫苗的保護(hù)效果，為對蝦抗WSSV的DNA疫苗的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。
[0008] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明提供了一種外周血中分離富集造血干細(xì)胞的 方法的處理方案，具體如下：
[0009] -種外周血中分離富集造血干細(xì)胞的方法，步驟如下：
[0010] 步驟1:自體血漿的制備階段，具體如下：
[0011] (1-1)抽取病人80ml血液，至抗凝管中；
[0012] (1-2)將抗凝血1800r/m離心lOmin，血液分層，吸上層澄清液體即自體血衆(zhòng)，于 56°C水浴滅活30min后，2500r/m離心10min，去除沉淀，放置于2-8°C條件下保存1-7天；
[0013] 步驟2:羥乙基淀粉（HES)去紅細(xì)胞階段，具體如下：
[0014] 將離心吸取血漿后剩余的下層血細(xì)胞部分，與羥乙基淀粉溶液按1:5的體積比例 完全混勻，使得羥乙基淀粉質(zhì)量百分比的終濃度為：1.2%，然后60Xg離心lOmin，取上清 液備用；
[0015] 步驟3 :單個核細(xì)胞的制備，具體如下：
[0016] (3-1)將步驟2中備用的上清，用含胎牛血清、不含Ca2+和Mg2+離子、ρΗ7· 2的磷 酸鹽緩沖液（DPBs)按1:2的體積比例稀釋并混勻備用；
[0017] (3-2)吸取20mlFicoll液，加入50ml離心管底部，并使得管壁上不要殘留Ficoll 液；
[0018] (3-3)將（3-1)中稀釋好的上清液緩慢鋪平于Ficoll液面上，F(xiàn)icoll液于上清 液的體積比例為1:1. 25,平衡后800Xg離心20min;(3-4)吸取白細(xì)胞層，用磷酸鹽緩沖液 (DPBs)稀釋懸浮1600r/m離心5min后去上清；
[0019] (3-5)用磷酸鹽緩沖液（DPBs)懸浮離心后的細(xì)胞沉淀1600r/m離心5min洗滌一 次；
[0020] (3-6)用含質(zhì)量百分比為5%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌一次，方式同步 驟（3-5)，去上清收集細(xì)胞并計數(shù)；
[0021] 步驟4 :單個核細(xì)胞（MNC)體外富集培養(yǎng)階段，具體如下：
[0022] (4-1)配置造血干細(xì)胞培養(yǎng)體系，由此而得造血干細(xì)胞培養(yǎng)基：
[0023](4-2)用造血干細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5X106/ml，接種于75cm2的細(xì)胞培養(yǎng) 瓶中置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱孵育120min;
[0024] (4-3)收集培養(yǎng)瓶中的非貼壁的細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至另一 75cm2的培養(yǎng)瓶中置于 37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，即可去除貼壁的細(xì)胞。
[0025] (4-4)采取1/2換液法，每3天用PBS清洗一次細(xì)胞并更換一次培養(yǎng)基；
[0026] (4-5)富集培養(yǎng)7天后，計數(shù)并檢測⑶34+陽性率；
[0027] 步驟5:⑶34+造血干細(xì)胞的獲得階段，具體如下：
[0028] (5-1)培養(yǎng)7天后，對步驟4中的單個核細(xì)胞計數(shù)，并1400r/m離心5min收集單個 核細(xì)胞；
[0029] (5-2)用不含Ca2+和Mg2+離子、ρΗ7· 2的磷酸鹽緩沖液（DPBs)清洗一遍，1400r/ m離心5min，棄上清；
[0030] (5-3)計算細(xì)胞濃度，按每1X10s個細(xì)胞用300μLBuffer液的比例重懸細(xì)胞，不 足1X10s個細(xì)胞按1X108個計算；
[0031] (5-4) (5-3)中體系每1X10s個細(xì)胞加入100μLFCR阻斷劑抑制非特異性或FC 受體介導(dǎo)的結(jié)合⑶34震蕩15s混勻；
[0032] (5-5) (5-4)中體系加入100μL抗CD34磁珠，震蕩15s混勻，并置于4°C冰箱孵育 30min；
[0033] (5-6) (5-5)中體系加入5mLBuffer液吹打混勻，并300Xg離心llmin后棄上清， 用500μLBuffer液重懸單個核細(xì)胞；
[0034] (5-7)選擇MS+吸附柱置于磁場中，將（5-6)中重懸的單個細(xì)胞Buffer液通過磁 場中的吸附柱，未與