一種培育無選擇標(biāo)記抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物的方法及其專用載體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種培育無選擇標(biāo)記抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物的 方法及其專用載體。
【背景技術(shù)】
[0002] 自1983年世界上首例轉(zhuǎn)基因煙草（Nicotianatabacum)在美國成功種植以來 (Zambryskitetal.，1983)，轉(zhuǎn)基因作物種植面積持續(xù)增加。截止2014年，全球28個(gè)國家 轉(zhuǎn)基因作物的種植面積為1. 815億公頃，比2013年的1. 752億公頃增加了 630萬公頃，年增 長率為3%~4%。轉(zhuǎn)基因作物的抗除草劑性狀自1996年商業(yè)化種植以來對(duì)全球糧食、飼 料和纖維生產(chǎn)做出了巨大的貢獻(xiàn)，2014年抗除草劑性狀被單獨(dú)或復(fù)合應(yīng)用于玉米、水稻、棉 花、油菜、苜蓿、茄子、甜菜和白楊等主要糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物（James，2015)。通過轉(zhuǎn)基因技 術(shù)使農(nóng)作物獲得對(duì)除草劑的耐性，不僅克服了除草劑的選擇性問題，使多滅生性廣譜除草 劑得到廣泛應(yīng)用，而且更重要的是提高了除草劑效果，降低了除草成本。當(dāng)前，中國的水稻、 玉米、大豆、小麥和油菜等作物雜草危害相當(dāng)嚴(yán)重，而傳統(tǒng)的選擇性除草劑在使用過程中需 要增加施用量，且殘留期長、容易影響后續(xù)作物的正常生長。因此，在中國開展抗除草劑轉(zhuǎn) 基因育種具有巨大的市場需求。
[0003] 所有除草劑都是通過干擾與抑制植物生長發(fā)育過程中的代謝作用而造成雜草的 死亡，其中包括光合作用、細(xì)胞分裂、氨基酸、蛋白質(zhì)及脂肪酸合成、激素合成、葉綠素及色 素合成等。除草劑草甘膦（glyphosate)特異性地抑制植物和細(xì)菌中芳香族氨基酸合成關(guān) 鍵酶的活性，即抑制植物和細(xì)菌中5-稀醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶（5-enolypyruvylshiki mate-3-phosphatesynthase，EPSPS)的活性。當(dāng)施用草甘膦時(shí)，進(jìn)入植物體內(nèi)的草甘膦分 子與磷酸烯醇丙酮酸競爭性地結(jié)合EPSPS的活性位點(diǎn)，終止了芳香族氨基酸的合成途徑， 造成苯丙氨酸、絡(luò)氨酸和色氨酸等氨基酸的缺乏，最終導(dǎo)致植物死亡。
[0004] 隨著植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，研究人員可以利用多種轉(zhuǎn)化方法將抗草甘膦基因轉(zhuǎn) 化到植物體內(nèi)，但通常只有部分細(xì)胞可以成為穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。因此，一般在轉(zhuǎn)化過程中使 用抗生素抗性基因等作為選擇標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在選擇壓力下，不含選擇標(biāo)記及其 產(chǎn)物的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞將死亡；轉(zhuǎn)化細(xì)胞和組織則整合有選擇標(biāo)記基因而存在抗性，從而能夠 繼續(xù)成活并分化成植株。但是，選擇標(biāo)記基因及其蛋白產(chǎn)物畢竟不是基因工程的目的產(chǎn)品， 盡管目前的研究表明多數(shù)選擇標(biāo)記基因及其產(chǎn)物并未帶來安全性隱患，但有些人仍會(huì)擔(dān)心 這些基因存在于轉(zhuǎn)基因植物中會(huì)帶來影響環(huán)境和人類健康安全性的問題。如果培育出不含 選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植物，這個(gè)問題即會(huì)迎刃而解?？偠灾?，建立無選擇標(biāo)記植物抗草 甘膦的轉(zhuǎn)基因水稻的培育方法具有重要的意義，不僅為培育抗逆、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的新品種提供 重要的材料基礎(chǔ)，同時(shí)隨著抗除草劑作物種植面積的擴(kuò)大和市場效益的提高，必將進(jìn)一步 推動(dòng)新型除草劑的開發(fā)和利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是培育無選擇標(biāo)記抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物。
[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明首先提供了 一種植物表達(dá)載體。
[0007] 本發(fā)明所提供的植物表達(dá)載體，包含區(qū)段甲和區(qū)段乙；
[0008] 所述區(qū)段甲依次可包括如下元件：T-DNA右邊界、選擇標(biāo)記基因表達(dá)盒、T-DNA左 邊界；
[0009] 所述區(qū)段乙依次可包括如下元件：T-DNA右邊界、抗除草劑基因表達(dá)盒、T-DNA左 邊界。
[0010] 所述區(qū)段甲中的T-DNA右邊界和所述區(qū)段乙中的T-DNA右邊界的核苷酸序列均可 如序列表中序列1自5'末端起第491至516位所示。
[0011] 所述區(qū)段甲中的T-DNA左邊界和所述區(qū)段乙中的T-DNA左邊界的核苷酸序列均可 如序列表中序列1自5'末端起第7182至7207位所示。
[0012] 所述區(qū)段乙依次可包括如下元件：所述T-DNA右邊界、MAR序列甲、所述抗除草劑 基因表達(dá)盒、MAR序列乙和所述T-DNA左邊界。
[0013] 所述MAR序列甲和所述MAR序列乙均可為核基質(zhì)結(jié)合序列，置于外源表達(dá)結(jié)構(gòu)的 兩側(cè)可提高外源基因表達(dá)的水平，或明顯減少了外源基因在轉(zhuǎn)基因植株間的表達(dá)差異。利 用MARs來穩(wěn)定、提高外源基因的表達(dá)是克服外源基因失活的一種有效方法。
[0014] 所述植物表達(dá)載體中，所述選擇標(biāo)記基因表達(dá)盒和所述抗除草劑基因表達(dá)盒的方 向相反。
[0015] 所述選擇標(biāo)記基因表達(dá)盒的核苷酸序列的反向互補(bǔ)序列可如序列表中序列1自 5'末端起第13533至15604位所示。
[0016] 所述抗除草劑基因表達(dá)盒的核苷酸序列可如序列表中序列1自5'末端起第1797 至5620位所示。
[0017] 所述除草劑可為草甘膦。
[0018] 所述抗除草劑基因具體可為EPSPS基因；
[0019] 所述EPSPS基因的核苷酸序列可如序列表中序列1自5'末端起第3708至5351 位所示。
[0020] 所述區(qū)段甲的核苷酸序列的反向互補(bǔ)序列可如序列表中序列1自5'末端起第 13458至276位所示（序列表中序列1為環(huán)形質(zhì)粒的序列，因此所述區(qū)段甲自上游至下游依 次由序列表中序列1自5'末端起第13458至15859位核苷酸和序列表中序列1自5'末端 起第1至276位所示核苷酸組成）。
[0021] 所述區(qū)段乙的核苷酸序列可如序列表中序列1自5'末端起第491至7207位所示。
[0022] 所述植物表達(dá)載體具體可為環(huán)狀質(zhì)粒。
[0023] 所述植物表達(dá)載體的核苷酸序列可如序列表中序列1所示。
[0024] 上述任一所述植物表達(dá)載體在培育無選擇標(biāo)記抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用也 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0025] 本發(fā)明還提供了一種培育無選擇標(biāo)記抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0026] 本發(fā)明所提供的培育無選擇標(biāo)記抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物的方法，可包括bl)或b2):
[0027] bl)將上述任一所述植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體植物，借助所述選擇標(biāo)記基因或其對(duì) 應(yīng)的表型進(jìn)行篩選，得到T。代植株；將所述T。代植株進(jìn)行自交，得到含有所述抗除草劑基因 且不含有所述選擇標(biāo)記基因的?\代植株，即無選擇標(biāo)記抗除草劑轉(zhuǎn)基因植株；
[0028] b2)將上述任一所述植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體植物，借助條件甲和條件乙進(jìn)行篩選， 得到T。代植株；將所述T。代植株進(jìn)行自交，得到含有所述抗除草劑基因且不含有所述選擇 標(biāo)記基因的?\代植株，即無選擇標(biāo)記抗除草劑轉(zhuǎn)基因植株；所述條件甲為所述選擇標(biāo)記基 因或其對(duì)應(yīng)的表型；所述條件乙為所述抗除草劑基因或其對(duì)應(yīng)的表型。
[0029] 上述方法中，用所述植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體植物時(shí)，所述抗除草劑基因和所述選 擇標(biāo)記基因通常非連鎖整合到受體植物的基因組中，所述具有選擇標(biāo)記基因表型的植株在 很大概率上也具有所述抗除草劑基因。同時(shí)具有抗除草劑基因和所述選擇標(biāo)記基因的植株 進(jìn)行自交后，獲得的后代中抗除草劑基因和選擇標(biāo)記基因發(fā)生分離，因此可以獲得無選擇 標(biāo)記抗除草劑轉(zhuǎn)基因植株。
[0030] 所述受體植物可為如下al)至a6)中的任一種：
[0031] al)雙子葉植物；
[0032] a2)單子葉植物；
[0033] a3)水稻；
[0034] a4)秈稻；
[0035] a5)水稻品種明恢86 ;
[0036] a6)粳稻。
[0037] 所述除草劑可為草甘膦。
[0038] 所述抗除草劑基因具體可為EPSPS基因；
[0039] 所述EPSPS基因的核苷酸序列可如序列表中序列1自5'末端起第3708至5351 位所示。
[0040] 所述選擇標(biāo)記基因可為潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因。
[0041] 所述潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因的核苷酸序列可如序列表中序列1自5'末端起 第13777至14799位所示。
[0042] 實(shí)驗(yàn)證明，利用本發(fā)明提供的方法，可篩選出無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因后代，獲得無選 擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因水稻的比率為42. 39% ;與野生型水稻幼苗相比，利用本發(fā)明提供的方法培 育的無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)草甘膦有明顯的抗性?？梢姡S著抗除草劑作物種植面積 的擴(kuò)大和市場效益的提高，本發(fā)明提供的方法將進(jìn)一步推動(dòng)新型除草劑的開發(fā)和利用。
【附圖說明】
[0043] 圖1為植物表達(dá)載體pDTepsps-hyg的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0044] 圖2為水稻的遺傳轉(zhuǎn)化。
[0045] 圖3為T。代轉(zhuǎn)基因水稻植株的PCR分析電泳圖。
[0046] 圖4為T。代轉(zhuǎn)基因水稻植株的hpt基因和印sps基因連鎖情況的電泳圖。
[0047] 圖5為?\代轉(zhuǎn)基因水稻植株的PCR分析電泳圖。
[0048] 圖6為Τ2代轉(zhuǎn)基因水稻植株的草甘膦抗性分析。
【具體實(shí)施方式】
[0049] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0050] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0051] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0052] 秈稻品種明恢86記載于如下文獻(xiàn)中：蘇軍等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)秈稻明恢86高效穩(wěn)定 轉(zhuǎn)化體系的建立。福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2003，18 (4)，209-213.公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生 物學(xué)研究所獲得。秈稻品種明恢86以下簡稱為明恢86或野生型水稻。
[0053] YEB液體培養(yǎng)基：將牛肉浸膏5g、酵母膏l(xiāng)g、蛋白胨5g、蔗糖5g、MgS04*7H20 0.04g 溶于1L去離子水，用10M NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至7. 2,高溫高壓滅菌20min。
[0054] 誘導(dǎo)培養(yǎng)基：將50XN6大量母液20mL、100XB5微量母液10mL、200XMS鐵鹽母 液5mL、1000 XB5有機(jī)母液lmL、水解酪蛋