Pml基因和rara基因檢測(cè)探針及其制備方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)，特別是涉及PML基因和RARA基因檢測(cè)探針及其制備方法和 試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋcutepromyelocyteleukemia，APL)是一類非淋巴細(xì)胞 白血病，臨床表現(xiàn)兇險(xiǎn)，起病及治療過程中容易發(fā)現(xiàn)出血和栓塞而引起死亡，但對(duì)誘導(dǎo)分化 治療反應(yīng)表現(xiàn)好。98%以上APL有著特異的基因表型，表現(xiàn)為t(15 ;17) (q22 ;q21)相互易 位，易位形成的PML/RARa融合基因表達(dá)蛋白顯性負(fù)抑制作用抑制早幼粒細(xì)胞分化成熟， 使細(xì)胞阻斷在早幼粒階段，抑制其分化。近二十年來，全反式維甲酸（ATRA)及砷劑的臨床 應(yīng)用使APL成為可以治愈的白血病之一。
[0003] 檢測(cè)PML/RARα融合基因是診斷APL最特異、敏感的方法之一，也是APL治療方案 選擇、療效分析、預(yù)后分析和復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)最可靠的指標(biāo)。通過細(xì)胞遺傳學(xué)方法（染色體和熒光 原位雜交法）檢測(cè)t(15 ;17)陽性即可診斷APL。
[0004]目前常用的檢測(cè)方法中，染色體分析需要進(jìn)行外周血培養(yǎng)，耗時(shí)長(zhǎng)，過程復(fù)雜，檢 測(cè)結(jié)果判斷對(duì)經(jīng)驗(yàn)要求高；分子生物學(xué)（如PCR方法）直接進(jìn)行RNA融合基因檢測(cè)，檢測(cè)靈 敏度高，但只能檢測(cè)已知融合類型；而FISH方法操作簡(jiǎn)單，可以檢測(cè)90%的典型易位和約 5%的不典型易位，報(bào)告速度快，有利于快速靶向治療。
[0005]焚光原位雜交（FluorescenceinsituhybridizationFISH)是 20 世紀(jì) 80 年代 末期在原有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性原位雜交技術(shù)。目前 這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分 析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究待許多領(lǐng)域。FISH的基本原理是用已知 的標(biāo)記核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行異性結(jié)合，形 成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因 而可以探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。與傳統(tǒng)的放射性標(biāo) 記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)、雜交特異性高和可以多重染色等特 點(diǎn)，因此在分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域受到普遍關(guān)注。
[0006] 雜交所用的探針大致可以分類三類：1)染色體特異重復(fù)序列探針，例如α衛(wèi)星、 衛(wèi)星III類的探針，其雜交靶位常大于1Mb，不含散在重復(fù)序列，與靶位結(jié)合緊密，雜交信 號(hào)強(qiáng)，易于檢測(cè)；2)全染色體或染色體區(qū)域特異性探針，其由一條染色體或染色體上某一 區(qū)段上極端不同的核苷酸片段所組成，可由克隆到噬菌體和質(zhì)粒中的染色體特異大片段獲 得；3)特異性位置探針，由一個(gè)或幾個(gè)克隆序列組成。
[0007] 探針的熒光素標(biāo)記可以采用直接和間接標(biāo)記的方法。間接標(biāo)記是采用生物素標(biāo)記 DNA探針，雜交之后用藕聯(lián)有熒光素親和素或者鏈霉親和素進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)還可以利用親和 素-生物素-熒光素復(fù)合物，將熒光信號(hào)進(jìn)行放大，從而可以檢測(cè)500bp左右的片段。而直 接標(biāo)記法是將熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價(jià)結(jié)合，或在缺口平移法標(biāo)記探 針時(shí)將熒光素核苷三磷酸摻入。直接標(biāo)記法在檢測(cè)時(shí)步驟簡(jiǎn)單，臨床使用方便。
[0008] 而目前對(duì)于PML/RARA基因FISH檢測(cè)，還缺少特異性高的檢測(cè)試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的之一是提供一種PML基因和RARA基因檢測(cè)探針及其制備方法，所制 備的探針可用于檢測(cè)PML基因和RARA基因狀態(tài)，即檢測(cè)PML基因和RARA基因檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)細(xì) 胞和染色體中直接觀察信號(hào)，具有很好的特異性。
[0010] 實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0011] 一種PML基因和RARA基因檢測(cè)探針的制備方法，包括以下步驟：
[0012] (4)選取針對(duì)PML基因的BAC克隆為RP11-832J18、CTD-2529B11、RP11-756N20和 RP11-1031J4中至少一種，和選取針對(duì)RARA基因的BAC克隆為CTD-2360L10、RP11-737D6、 CTD-3087022、RP11-48010和CTD-2134K5中至少一種；
[0013] (5)對(duì)克隆分別提取質(zhì)粒，得到質(zhì)粒DNA，定量；
[0014] (6)用熒光素標(biāo)記質(zhì)粒DNA，針對(duì)同一種基因的質(zhì)粒DNA所標(biāo)記的熒光素相同，針 對(duì)PML基因和針對(duì)RARA基因的檢測(cè)探針標(biāo)記的熒光素的顏色不相同，即得。
[0015] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述PML探針的BAC克隆為RP11-832J18、CTD-2529B11、 RP11-756N20 和RP11-1031J4。
[0016] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述RARA探針的BAC克隆為CTD-2360L10、RP11-737D6、 CTD-3087022、RP11-48010和CTD-2134K5。
[0017] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，標(biāo)記熒光素選擇本領(lǐng)域已知的熒光染料，優(yōu)選地，熒光素為 AlexafltlO；r?488、FITC、AlexaFlllOT?555>Rhodamine、TexasRed、pacificHue?、 DEAC〇
[0018] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，基因探針的標(biāo)記可以采用現(xiàn)有技術(shù)中的方法將相應(yīng)熒光素 標(biāo)記至雙鏈核酸上，所述方法包括但不限于：隨機(jī)引物法、切口平移等，標(biāo)記基因探針可以 使用市售的缺口平移標(biāo)記試劑盒和隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒，優(yōu)選abbott和Roche公司的Nick Translation Kit。本發(fā)明步驟（3)優(yōu)選采用隨機(jī)引物法、切口平移法對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行焚光 素豐不記。
[0019] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述標(biāo)記的溫度為15°C-18°C，標(biāo)記的時(shí)間為8-12小時(shí)。
[0020] 本發(fā)明的另一目的是提供一種PML基因和RARA基因檢測(cè)試劑盒。
[0021] 實(shí)現(xiàn)該目的技術(shù)方案如下。
[0022] 一種PML基因和RARA基因檢測(cè)試劑盒，包括有上述PML基因和RARA基因檢測(cè)探 針。
[0023] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，還包括有用于封閉重復(fù)序列的COTHumanDNA，和DAPI復(fù)染 劑。
[0024] 本發(fā)明具有以下有益效果：
[0025](1)本發(fā)明通過篩選到最優(yōu)的PML/RARA融合基因檢測(cè)探針及其組合，采用 FISH(Fluorescence In-Situ Hybridization)方法對(duì)PML/RARA融合基因檢測(cè)，信號(hào)計(jì)數(shù)行 準(zhǔn)確、快速，且結(jié)果的重復(fù)性好；補(bǔ)充了臨床中PML/RARA融合檢測(cè)依賴進(jìn)口的不足，有利于 篩選更多受益于靶向藥物的患者，提高急性早幼粒細(xì)胞白血病患者生存率和總生存期。
[0026] (2)本發(fā)明優(yōu)選克隆檢測(cè)特異性好，靈敏度高。通過對(duì)大片段重排的直觀檢測(cè)，不 易遺漏復(fù)雜變異類型，對(duì)未知融合類型也有很好的鑒別性。
[0027] (3)通過本發(fā)明所述的檢測(cè)急性早幼粒細(xì)胞白血病PML/RARA融合試劑盒，從基因 水平了解PML/RARA融合狀態(tài)改變，多種信號(hào)類型表現(xiàn)出實(shí)體組織的腫瘤細(xì)胞遺傳多樣性， 可以實(shí)現(xiàn)在腫瘤生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用，有助綜合評(píng)價(jià)各分子標(biāo)志物，輔助臨床 靶向治療用藥及治療方案選擇。
【附圖說明】
[0028] 圖1A為是實(shí)施例1中PML基因檢測(cè)探針序列的不意圖。
[0029] 圖1B為是實(shí)施例1中RARA基因檢測(cè)探針序列的不意圖。
[0030] 圖2為實(shí)施例1中人外周血培養(yǎng)細(xì)胞片PML基因和RARA基因檢測(cè)探針FISH檢測(cè) 結(jié)果圖。
[0031] 圖3為實(shí)施例4中臨床骨髓樣本FISH檢測(cè)結(jié)果圖，其中，檢測(cè)信號(hào)類型為2R2G， PML/RARA融合基因檢測(cè)陰性。
[0032] 圖4為實(shí)施例4中臨床骨髓樣本FISH檢測(cè)結(jié)果圖，其中，檢測(cè)信號(hào)類型為1R1G2F， PML/RARA融合基因檢測(cè)陽性。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 為了便于理解本發(fā)明，下面將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。本發(fā)明可以以許多不 同的形式來實(shí)現(xiàn)，并不限于本文所描述的實(shí)施例。相反地