一種小鼠陰道上皮細胞體外培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于細胞培養(yǎng)技術領域，具體涉及一種小鼠陰道上皮細胞體外培養(yǎng)方法，尤其涉及采用酶消化法來進行小鼠陰道上皮的原代培養(yǎng)方法。
【背景技術】
[0002]對小鼠陰道上皮細胞的體外培養(yǎng)，國內外有研究采用組織塊法培養(yǎng)陰道上皮細胞，雖然操作簡單，但耗時長，傳代周期長。
[0003]近年來用酶消化法分離出小鼠陰道上皮層，繼續(xù)用酶消化法消化上皮層為單細胞懸液，成功培養(yǎng)后用于組織工程化陰道研究，但由于在小鼠陰道上皮原代培養(yǎng)過程中，獲取細胞數量少、不能貼壁以及傳代能力差等問題，目前還沒有在較短時間內獲得大量、高純度種子細胞，用于對陰道上皮的生理、病理變化，癌變過程的觀察和組織工程的構建。因此如何克服現有技術的不足是目前細胞培養(yǎng)技術領域亟需解決的問題。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是為了解決現有技術的不足，提供一種小鼠陰道上皮細胞體外培養(yǎng)方法，該方法不僅操作方便，而且獲取的細胞數量大，純度高，活力多，且能穩(wěn)定的傳代4-5代，能對陰道上皮的生理、病理變化，癌變過程及組織工程化陰道的構建提供種子細胞。
[0005]為實現上述目的，本發(fā)明采用的技術方案如下:
一種小鼠陰道上皮細胞體外培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
步驟(1)，取小鼠離體的陰道組織，將其剪成(0.9-1.l)cmX (0.4-0.6)cm大小，然后用4°〇含雙抗的PBS作為清洗液進行清洗，清洗至清洗液澄清后，將陰道組織與2U/ml的中性蛋白酶Π型按照1:1.9-2.1的體積比混合，4°C冰箱過夜；
步驟(2)，將經步驟(1)過夜培養(yǎng)的陰道組織進行分離，分離出上皮層組織和固有層組織，棄固有層組織，然后將上皮層組織與0.25%胰酶-0.02%EDTA按照1:1.9-2.1的體積比混合，于37°C消化陰道上皮層組織9.5-10.5min，然后用無菌槍頭吹打上皮層至消化的陰道上皮層組織細胞吹散，再于37°C消化陰道上皮組織9.5-10.5min后，再次無菌槍頭吹打上皮層至消化的陰道上皮層組織細胞吹散后，加入與0.25%胰酶-0.02%EDTA同體積的含10%胎牛血清的DMEM/F12終止消化，得到細胞懸液；
步驟(3)，將步驟(2)得到的細胞懸液通過200目尼龍濾膜過濾，取濾液，然后將濾液離心，棄上清，然后再加入是步驟(1)0.25%胰酶-0.02%EDTA體積的1-1.5倍的重懸細胞，再次離心，棄上清，加入EPILIFE重懸，使細胞密度達到1*105-1*106個/ml，放于培養(yǎng)瓶內，然后置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第2天后首次換液，換液時，用無菌槍頭棄去舊培養(yǎng)基，加入是步驟(1 )0.25%胰酶-0.02%EDTA體積的1_2倍的PBS以洗去漂浮的細胞和殘留的舊培養(yǎng)基，棄去PBS后，再加入是步驟(1 )0.25%胰酶-0.02%EDTA體積的6-7倍的新的EPILIFE，繼續(xù)放入37°C、5%C02的C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，以后每兩天換液1次;到第7-9天細胞的融合度達到80%-90%，就可傳代。
[0006]進一步，優(yōu)選的是步驟(3)所述的離心速度為900_1100r/min，離心時間為4_6min。
[0007]進一步，優(yōu)選的是步驟(3)所述的離心速度為1000r/min，離心時間為5min。
[0008]進一步，優(yōu)選的是所述的小鼠陰道上皮細胞體外培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
步驟(1)，取小鼠離體的陰道組織，將其剪成lcm X 0.5cm大小，然后用4°C含雙抗的作為清洗液進行清洗，清洗至清洗液澄清后，將陰道組織與2U/ml的中性蛋白酶Π型(Dispase Π )按照1:2的體積比混合，4°C冰箱過夜；
步驟(2)，將經步驟(1)過夜培養(yǎng)的陰道組織進行分離，分離出上皮層組織和固有層組織，棄固有層組織，然后將上皮層組織與0.25%胰酶-0.02%EDTA按照1: 2的體積比混合，于37°C消化陰道上皮層組織lOmin，然后無菌搶頭輕輕吹打上皮層30s，再于37°C消化陰道上皮組織lOmin后，再次輕輕吹打上皮層30s后，加入與0.25%胰酶-0.02%EDTA同體積的含10%胎牛血清的DMEM/F12終止消化，得到細胞懸液；
步驟(3)，將步驟(2)得到的細胞懸液通過200目尼龍濾膜過濾，取濾液，然后將濾液于1000r/min的速度下離心5min，棄上清，然后再加入是步驟(1 )0.25%胰酶-0.02%EDTA體積的1-1.5倍的?83重懸細胞，再次1000r/min的速度下離心5min后，棄上清，加入EPILIFE重懸，使細胞密度達到1*105_1*106個/ml，放于25cm2的培養(yǎng)瓶內，然后置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第2天后首次換液，用無菌槍頭棄去舊培養(yǎng)基，加入是步驟(1)0.25%胰酶-0.02%EDTA體積的1-2倍的PBS輕輕搖晃瓶子，洗去漂浮的細胞和殘留的舊培養(yǎng)基，棄去PBS后，再加入是步驟(1)0.25%胰酶-0.02%EDTA體積的6-7倍的新的EPILIFE，繼續(xù)放入37°C、5%C02的C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，以后每兩天換液1次;到第7-9天細胞的融合度達到80%-90%，就可傳代。
[0009]本發(fā)明與現有技術相比，其有益效果為:
本發(fā)明采用酶分步消化法進行培養(yǎng)細胞，不僅操作方便，而且獲取的細胞數量是組織消化法的2-3倍，純度可達90%以上，活力達90%以上，且能穩(wěn)定的傳代4-5代，能對陰道上皮的生理、病理變化，癌變過程及組織工程化陰道的構建提供種子細胞。
【附圖說明】
[0010]圖1為光鏡下(10X)原代細胞培養(yǎng)至第二天的生長情況；
圖2為光鏡下(10 X)原代細胞培養(yǎng)至第四天的生長情況；
圖3為光鏡下(10 X)原代細胞培養(yǎng)至第六天的生長情況；
圖4為光鏡下(10 X)原代細胞培養(yǎng)至第八天的生長情況；
圖5為光鏡下(40 X)的HE染色圖；
圖6為光鏡下(20 X)的HE染色圖；
圖7為光鏡下(10 X)的HE染色圖；
圖8為光鏡下(4 X)的HE染色圖；
圖9為電鏡下(X 2.0k)原代細胞培養(yǎng)至第二天的生長情況；
圖10為電鏡下(X 1.0k)原代細胞培養(yǎng)至第四天的生長情況；
圖11為電鏡下(X 1.0k)原代細胞培養(yǎng)至第六天的生長情況；
圖12為電鏡下(X 300)原代細胞培養(yǎng)至第八天的生長情況；
圖13為光譜抗角蛋白(P-CK，40X)免疫組織化學染色培養(yǎng)至第四天的原代細胞圖；
圖14為光譜抗角蛋白(P-CK，20X)免疫組織化學染色培養(yǎng)至第四天的原代細胞圖； 圖15為光譜抗角蛋白(P-CK，10X)免疫組織化學染色培養(yǎng)至第四天的原代細胞圖；
圖16為細胞角蛋白5/6(CK5/6，40X)免疫組織化學染色培養(yǎng)至第四天的原代細胞圖；
圖17為細胞角蛋白5/6(CK5/6，20X)免疫組織化學染色培養(yǎng)至第四天的原代細胞圖；
圖18為細胞角蛋白5/6(CK5/6，10X)免疫組織化學染色培養(yǎng)至第四天的原代細胞圖；
圖19為細胞角蛋白5/6(CK5/6，4X)免疫組織化學染色培養(yǎng)至第四天的原代細胞圖。
【具體實施方式】
[0011]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。
[0012]本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過購買獲得的常規(guī)廣品。
[0013]含雙抗的PBS:含青霉素100U/mL，鏈霉素100U/mL，購自于Solar 1 ；
EPILIFE:含0.02 mM氯化|丐(Gali2)，膜島素生長因子-l(Insulin_Growth Factor-1)5yg/ml，氫化可的松(Hydrocortisone)0.18mg/mL，牛轉鐵蛋白(Bovine Transferrin) 2.5mg/mL ,慶大霉素/兩性霉素B(Gentamicin/AmphotericinB) lmL，表皮生長因子(epidemal growth factor ,EGF) 200ng/mL，牛腦垂體提取物(bovine pituitaryextract,ΒΡΕ) 24 mg protein/mL，購自于GIBIC0;
含10%胎牛血清(v/v)的DMEM/F12:購自于GIBIC0;
0.25% 胰酶-0.02%EDTA，購自于 GIBIC0 ；
胎牛血清(FBS)，購自于sigma;
中性蛋白酶Π型(Dispase Π)，購自于sigma。
[0014]實施例1
一種小鼠陰道上皮細胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟:
步驟(1)，取小鼠離體的陰道組織，將其剪成0.9cmX0.6cm大小，然后用4°C含雙抗的PBS作為清洗液進行清洗，清洗至清洗液澄清后，將陰道組織與2U/ml的中性蛋白酶Π型按照1:1.9的體積比混合，4°C冰箱過夜；
步驟(2)，將經步驟(1)過夜培養(yǎng)的陰道組織進行分離，分離出上皮層組織和固有層組織，棄固有層組織，然后將上皮層組織與0.25%胰酶-0.02%EDTA按照1:1.9的體積比混合，于37°C消化陰道上皮層組織9.5min，然后用無菌槍頭吹打上皮層至消化的陰道上皮層組織細胞吹散，再于37°C消化陰道上皮組織9.5min后，再次無菌槍頭吹打上皮層至消化的陰道上皮層組織細胞吹散后，加入與0.25%胰酶-0.02%EDTA同體積的含10%胎牛血清的DMEM/F12終止消化，得到細胞懸液；
步驟(3)，將步驟(2)得到的細胞懸液通過200目尼龍濾膜過濾，取濾液，然后將濾液于1100r/min的速度下離心4min，棄上清，然后再加入是步驟(1 )0.25%胰酶-0.02%EDTA體積的1倍的PBS重懸細胞，再次1100r/min的速度下離心4min后，棄上清，加入EPILIFE重懸，使細胞密度達到1*105_1*106個/ml，放于培養(yǎng)瓶內，然后置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第2天后首次換液，換液時，用無菌槍頭棄去舊培養(yǎng)基，加入是步驟(1 )0.25%胰酶-0.02%EDTA體積的1倍的PBS以洗去漂浮的細胞和殘留的舊培養(yǎng)基，棄去PBS后，再加入是步驟(1 )0.25%胰酶-0.02%EDTA體積的6倍的新的EPILIFE，繼續(xù)放入37°C、5%C02的C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，以后每兩天換液1次;到第7-9天細胞的融合度達到80%-90%，就可傳代。
[0015]實施例2
一種