使用光熱平臺(tái)向活細(xì)胞中的高通量運(yùn)輸物遞送的制作方法
【專利說明】使用光熱平臺(tái)向活細(xì)胞中的高通量運(yùn)輸物遞送
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年3月15日提交的USSN61/799,222的權(quán)益和優(yōu)先權(quán)，其全文出于 所有目的以引用的方式并入有本文。
[0003] 關(guān)于聯(lián)邦資助研究開發(fā)下完成的發(fā)明的權(quán)利聲明
[0004] 本發(fā)明在政府支持下進(jìn)行，由國家健康協(xié)會(huì)授予的資助號(hào)ΕΒ014456支持。政府享 有本發(fā)明的一定權(quán)利。
[0005] 背景
[0006] 將運(yùn)輸物(cargo)傳遞至寬尺寸范圍的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，包括蛋白質(zhì)、DNA、RNA、染 色體、細(xì)胞核以及無生命的顆粒，如量子點(diǎn)、表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)顆粒、以及微珠，在很 多生物學(xué)領(lǐng)域中是非常需要的。遞送方法如內(nèi)吞作用能夠使運(yùn)輸物內(nèi)陷在核內(nèi)體中，其中 低pH微環(huán)境和裂解酶經(jīng)常使得運(yùn)輸物降解(Luo和 病毒遞送和化學(xué)物遞送方法將運(yùn)輸物包裹在病毒內(nèi)或形成增強(qiáng)攝取的化學(xué)復(fù)合物 (Naldini 等人（1996)Science，272:263-267;Felgner 等人（1987) ?『〇(：.他七1.4〇&(1.3(^.1^4,84:7413-7417)。然而，毒性、細(xì)胞類型特異性攝取以及更重要的 是受限的運(yùn)輸物包裹能力對(duì)運(yùn)輸物尺寸和可傳遞的細(xì)胞類型施加重要的約束（Luo和 Saltzman，同上。) 〇
[0007] 物理傳遞方法包括電穿孔(Chu等人（1987)Nucleic Acids Res. 15:1311-1326)和 聲致穿孔(Mitragotri (2005)Nat ·Rev·Drug Discovery，4:255-260)，這些是產(chǎn)生隨機(jī)分布 的納米級(jí)孔的方法，以及光穿孔(Tirlapur和Konig( 2002 )Nature, 418:290-291; Vogel等人 (2005)Appl.Phys.B:Laser Opt.，81:1015_1047;Clark等人（2006)J.Biomed.0pt. ,11: 014034)，這是一種通過激光焦點(diǎn)在細(xì)胞膜上產(chǎn)生孔的方法。小的運(yùn)輸物通過熱擴(kuò)散或通過 電場(chǎng)經(jīng)由這些孔遞送至細(xì)胞中。然而，由于隨著孔徑的增加運(yùn)輸物擴(kuò)散速度降低且細(xì)胞活 力降低，所以使用這些方法遞送大的運(yùn)輸物具有較低的效率（Stevenson等人（2006) Opt.Express，14:7125-7133)。
[0008] 微毛細(xì)管注射使用銳利的玻璃尖端來機(jī)械地穿透細(xì)胞膜用于遞送(參見，例如， King(2004)Meth.Mo.Biol.,245：Gene Delivery to Mammalian Cells 1；Humana Press Inc. Totowa，NJ)。但是，為了維持細(xì)胞活力，來自膜穿透的機(jī)械性創(chuàng)傷將典型的移液管尖端 直徑限制在約0 · 5um(參見，例如，Han等人（2998) J·Nanomed·Nanotechno 1 ·Biol .Med·，4: 215-225)〇
[0009] 由于移液管堵塞和運(yùn)輸物剪切，所以大于移液管尖端的運(yùn)輸物不能被注射。電注 射(一種將電穿孔與微毛細(xì)管注射結(jié)合的方法）已經(jīng)證明了小分子如RNA和質(zhì)粒DNA向活細(xì) 胞中的遞送（參見，例如，Boudes等人（208)J.Neurosci .Meth·，170:204-211 ;Kitamura等人 (2008)Nat.Meth. ,5:61-67等）以及細(xì)菌向人工脂囊泡中的遞送(參見，例如Hurtig和Orwar (2008)Soft Matter，4:1515-1520)。電注射通過用電場(chǎng)弱化細(xì)胞膜，然后進(jìn)行輕柔的機(jī)械 穿透至細(xì)胞中而發(fā)揮作用。
[0010]簡(jiǎn)單的脂質(zhì)輔助顯微注射（31^1〇技術(shù)〇^€3行311和他116?(1998)8丨〇?1^8.了·， 75:2558-2563)在玻璃微毛細(xì)管的尖端處并入有合成的脂質(zhì)分子。SLAM微量移液管與細(xì)胞 膜的接觸允許脂質(zhì)分子與細(xì)胞膜融合以形成用于運(yùn)輸物遞送的連續(xù)的和臨時(shí)的路徑。這一 方法避免了微量移液管尖端穿過細(xì)胞膜造成的z字形刺穿動(dòng)作的問題。然而，運(yùn)輸物與細(xì)胞 膜之間的親脂性相互作用會(huì)在細(xì)胞中產(chǎn)生不想要的生物效應(yīng)，同樣，在遞送的運(yùn)輸物下，也 將此方法限制于特定的細(xì)胞類型和運(yùn)輸物含量。
[0011 ] 概述
[0012] 在某些實(shí)施方案中，提供用于遞送試劑(例如，核酸、蛋白質(zhì)、有機(jī)分子、細(xì)胞器、抗 體或其它配體等)至活細(xì)胞中和/或從所述細(xì)胞中提取這些試劑的方法、裝置和系統(tǒng)。在不 同的實(shí)施方案中，提供允許有效地、高通量地將運(yùn)輸物遞送至活細(xì)胞中的光熱平臺(tái)和并入 有這種光熱平臺(tái)的系統(tǒng)。
[0013] 在不同的方面，本文設(shè)想的發(fā)明可包括但不限于，任何一個(gè)或多個(gè)以下實(shí)施方案： [0014]實(shí)施方案1: 一種用于遞送試劑至細(xì)胞中的裝置，所述裝置包括多孔膜，其上沉積 有當(dāng)暴露于光學(xué)輻射時(shí)變熱的材料的薄膜涂層，其中所述薄膜涂層基本上沉積在包括所述 多孔膜的孔內(nèi)并且所述多孔膜的表面基本上沒有所述涂層。
[0015] 實(shí)施方案2:如實(shí)施方案1所述的裝置，其中在沉積所述薄膜之前，所述多孔膜的平 均孔徑在約l〇〇nm至約3μηι的范圍內(nèi)。
[0016] 實(shí)施方案3:根據(jù)實(shí)施方案1-2中任一個(gè)所述的裝置，其中所述薄膜包含選自由以 下組成的組的材料:金、銀、鈦(Ti)、TiN、TiCn以及TiAIN。
[0017] 實(shí)施方案4:根據(jù)實(shí)施方案1-2中任一個(gè)所述的裝置，其中所述薄膜包含鈦。
[0018] 實(shí)施方案5:根據(jù)實(shí)施方案1-4中任一個(gè)所述的裝置，其中所述薄膜的厚度范圍在 約10nm至約Ιμπι內(nèi)。
[0019] 實(shí)施方案6:根據(jù)實(shí)施方案1-5中任一個(gè)所述的裝置，其中所述多孔膜包括多孔氧 化鋁(Α12〇3)結(jié)構(gòu)。
[0020] 實(shí)施方案7:根據(jù)實(shí)施方案1-5中任一個(gè)所述的裝置，其中所述多孔膜包括聚酯膜。
[0021] 實(shí)施方案8:根據(jù)實(shí)施方案1-7中任一個(gè)所述的裝置，其中所述多孔膜與多個(gè)細(xì)胞 接觸或并列相鄰。
[0022] 實(shí)施方案9:如實(shí)施方案8所述的裝置，其中所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0023] 實(shí)施方案10:-種用于遞送試劑至細(xì)胞中的裝置，所述裝置包括：剛性基底，其包 括第一表面和在與所述第一表面相對(duì)側(cè)上的第二表面以及微孔口陣列，其中所述微孔口從 所述第一表面穿過所述基底至所述第二表面，其中所述微孔口具有小于約ΙΟμπι的最大直 徑，并且多個(gè)所述微孔口的至少一部分壁或邊緣和/或與所述微孔口相鄰的所述第一表面 的區(qū)域用當(dāng)暴露于光學(xué)輻射時(shí)變熱的材料的薄膜涂層涂覆；以及設(shè)置在鄰近所述第二表面 處的流體通道或流體貯存器，其中所述通道或貯存器與包括所述微孔口陣列的多個(gè)微孔口 流體連通;并且其中所述第一表面的面被設(shè)置來接收并支持和/或容納細(xì)胞。
[0024] 實(shí)施方案11:如實(shí)施方案10所述的裝置，其中所述微孔口具有約5μπι或更小的最大 直徑。
[0025] 實(shí)施方案12:如實(shí)施方案10所述的裝置，其中所述微孔口具有約3μπι或更小的最大 直徑。
[0026] 實(shí)施方案13:根據(jù)實(shí)施方案10-12中任一個(gè)所述的裝置，其中所述剛性基底由微光 刻晶片形成。
[0027] 實(shí)施方案14:根據(jù)實(shí)施方案10-13中任一個(gè)所述的裝置，其中所述剛性基底由選自 由以下組成的組的材料形成:硅、石英、剛性聚合物以及陶瓷。
[0028] 實(shí)施方案15:根據(jù)實(shí)施方案10-13中任一個(gè)所述的裝置，其中所述剛性基底由硅形 成。
[0029] 實(shí)施方案16:根據(jù)實(shí)施方案10-15中任一個(gè)所述的裝置，其中所述剛性基底，其中 所述第一表面包括被構(gòu)造來容納細(xì)胞并設(shè)置用于顯微鏡觀察的腔室的表面。
[0030] 實(shí)施方案17:如實(shí)施方案16所述的裝置，其中所述腔室具有開放的頂部。
[0031] 實(shí)施方案18:如實(shí)施方案16所述的裝置，其中所述腔室具有封閉所述腔室的頂部。
[0032] 實(shí)施方案19:根據(jù)實(shí)施方案10-18中任一個(gè)所述的裝置，其中所述微孔口陣列包括 至少5個(gè)、至少10個(gè)、至少15個(gè)、至少20個(gè)、至少25個(gè)、至少50個(gè)、至少100個(gè)、至少200個(gè)或至 少500個(gè)微孔口。
[0033]實(shí)施方案20:如實(shí)施方案19所述的裝置，其中所述孔口全部位于所述表面約2cm2 或更小，或者約1.5cm2或更小，或者約lcm2或更小，或者約0.5cm2或更小，或者約0. lcm2或更 小的面積內(nèi)。
[0034]實(shí)施方案21:根據(jù)實(shí)施方案10-20中任一個(gè)所述的裝置，其中所述薄膜沉積在所述 微孔口的一部分壁和/或一部分邊緣上。
[0035] 實(shí)施方案22:根據(jù)實(shí)施方案10-21中任一個(gè)所述的裝置，其中所述薄膜包括選自由 以下組成的組的材料:半導(dǎo)體、金屬、金屬合金、金屬氮化物以及金屬氧化物。
[0036] 實(shí)施方案23:如實(shí)施方案22所述的裝置，其中所述薄膜包括選自由以下組成的組 的材料:過渡金屬、過渡金屬合金、過渡金屬氮化物以及過渡金屬氧化物。
[0037] 實(shí)施方案24:如實(shí)施方案22所述的裝置，其中所述薄膜包括選自由以下組成的組 的材料:金、銀、鈦(Ti)、TiN、TiCn以及TiAIN。
[0038] 實(shí)施方案25:根據(jù)實(shí)施方案10-24中任一個(gè)所述的裝置，其中所述流體通道或腔室 裝置容納待遞送至細(xì)胞中的試劑。
[0039] 實(shí)施方案26:如實(shí)施方案25所述的裝置，其中所述試劑選自由以下組成的組：核 酸、核酶、蛋白質(zhì)或肽、酶、抗體、細(xì)胞器、染色體、病原體以及微?；蚣{米顆粒。
[0040] 實(shí)施方案27:根據(jù)實(shí)施方案10-26中任一個(gè)所述的裝置，其中所述通道或腔室被加 壓。
[0041] 實(shí)施方案28:如實(shí)施方案27所述的裝置，其中所述通道或腔室通過氣體壓力、栗或 重力供料進(jìn)行加壓。
[0042]實(shí)施方案29:根據(jù)實(shí)施方案10-28中任一個(gè)所述的裝置，其中所述裝置被配置來替 代倒置顯微鏡上的載物臺(tái)。
[0043]實(shí)施方案30:根據(jù)實(shí)施方案10-29中任一個(gè)所述的裝置，其中細(xì)胞設(shè)置在所述第一 表面上。
[0044]實(shí)施方案31:如實(shí)施方案30所述的裝置，其中所述細(xì)胞設(shè)置在所述基底的多個(gè)微 孔口上或鄰近所述多個(gè)微孔口。
[0045]實(shí)施方案32:根據(jù)實(shí)施方案30-31中任一個(gè)所述的裝置，其中所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物 細(xì)胞。
[0046] 實(shí)施方案33: -種用于選擇性地開放遞送試劑至細(xì)胞中的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括:根 據(jù)實(shí)施方案1-9中任一個(gè)所述的裝置和/或根據(jù)實(shí)施方案10-32中任一個(gè)所述的裝置；以及 能夠加熱所述薄膜的光能來源。
[0047] 實(shí)施方案34:如實(shí)施方案33所述的系統(tǒng)，其中所述光能來源為激光或非相干光源。 [0048]實(shí)施方案35:如實(shí)施方案34所述的系統(tǒng)，其中所述光能來源為激光。
[0049]實(shí)施方案36:根據(jù)實(shí)施方案33-35中任一個(gè)所述的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)包括透鏡系 統(tǒng)、系統(tǒng)和/或掩模，和/或引導(dǎo)光能至所述第一表面或所述多孔膜的特定區(qū)域的定位系統(tǒng)。
[0050] 實(shí)施方案37:根據(jù)實(shí)施方案33-36中任一個(gè)所述的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)包括被配置 來將光能聚焦到所述第一表面或所述多孔膜上的物鏡。
[0051] 實(shí)施方案38:如實(shí)施方案37所述的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)包括半波板