可溶性IFN-ε蛋白的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及可溶性IFN-ε蛋白的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 干擾素（IFNs)是一種多功能的分泌型蛋白質(zhì)，參與抗病毒、細(xì)胞生長調(diào)節(jié)、免疫調(diào) 節(jié)等過程。其中，I型干擾素在整個(gè)干擾素家族中占有很大比重，也是目前研究最多、應(yīng)用最 廣的干擾素。IFN-ε屬于I型干擾素家族，人的IFN-ε的編碼基因位于第9號(hào)染色體短臂上 (9p22.2)，沒有內(nèi)含子，全長編碼192個(gè)氨基酸。不同于其他干擾素，IFN-ε可以組成性表達(dá) 于人肺、腦、小腸和生殖組織等部位，它的這種表達(dá)使它可能具有了除I型干擾素抗病毒、抗 腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等作用之外的一些特性，但目前對(duì)其的研究還不清楚。
[0003]近期研究發(fā)現(xiàn)，IFN-ε可以在女性生殖道上皮細(xì)胞中組成性表達(dá)并且受雌激素的 調(diào)節(jié)，IFN-ε在女性生殖道感染的治療中是一個(gè)可以發(fā)揮強(qiáng)力效用的抗病原藥及免疫調(diào)節(jié) 細(xì)胞因子。因此，將IFN-ε蛋白制備成抗體用于治療女性生殖道感染等病癥將會(huì)對(duì)整個(gè)全球 人類健康具有重要貢獻(xiàn)。目前，但現(xiàn)今所報(bào)道出的文獻(xiàn)中所做的IFN-ε基因表達(dá)的蛋白一直 是在包涵體中表達(dá)而不具有天然的蛋白活性，從而不能用來制作抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的之一在于針對(duì)上述無法得到可溶性IFN-ε蛋白的問題，通過加入一種 分子伴侶使人IFN-ε基因在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達(dá)出可溶性的IFN-ε融合蛋白并純 化得到純度較高的IFN-ε蛋白，可以用來制作抗體。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0006]可溶性IFN-ε蛋白的制備方法，其具體步驟為：
[0007] (l)PCR擴(kuò)增
[0008]根據(jù)被證實(shí)的人IFN-ε基因的序列，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；
[0009] (2)酶切和連接
[0010] 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及pET40b質(zhì)粒進(jìn)行酶切，回收酶切后的IFN-ε基因和pET40b質(zhì)粒， 將二者按照體積比15:2的比例進(jìn)行連接；
[0011] (3)表達(dá)IFN-ε蛋白：
[0012]將步驟（2)得到的連接產(chǎn)物與分子伴侶共同轉(zhuǎn)入表達(dá)菌感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)40-48h，在培養(yǎng)過程中加入異丙基-β-D-硫代啦喃半乳糖苷；
[0013]⑷蛋白純化：
[0014]將IFN-ε蛋白與其他雜蛋白分離開。
[0015]所述感受態(tài)細(xì)胞(competentcell)是用理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞，使其處于最適攝取和 容納外來DNA的生理狀態(tài)的細(xì)胞。主要原理就是通過處理使細(xì)胞的通透性變大，直觀的說， 使得細(xì)胞膜表面出現(xiàn)一些孔洞，便于外源基因或載體進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。由于細(xì)胞膜的流動(dòng) 性，這種孔洞會(huì)被細(xì)胞自身所修復(fù)。
[0016]進(jìn)一步，步驟（1)中人IFN-ε基因的上游擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQIDN0:1所 示;人IFN-ε基因的下游擴(kuò)增引物的核苷酸序列如SEQIDN0:2所示。
[0017] 詳見下表：
[0019]進(jìn)一步，步驟（1)中所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為:先于94°C溫度下預(yù)熱5min;以94°C溫度下變性30s、58°C溫度下退火30s、72°C溫度下延伸1.5min為一個(gè)循環(huán)，共循環(huán)33次;在 72°C溫度下處理lOmin。
[0020] 進(jìn)一步，步驟(2)中酶切反應(yīng)具體步驟為:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及pET40b質(zhì)粒同時(shí)用EcoRI 和Xhol雙酶切，在37°C溫度下反應(yīng)2h。
[0021]進(jìn)一步，步驟(2)中連接反應(yīng)條件為:將酶切后的IFN-ε基因與pET40b質(zhì)粒在T4DNA 連接酶作用下，室溫下連接30min。
[0022] 進(jìn)一步，步驟(3)中加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的量為:使其在培養(yǎng)基中 的濃度為0.1mM/L。
[0023] 所述異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷英文名稱為IPTG，為白色粉末，是一種作用極 強(qiáng)的誘導(dǎo)劑，溶于水后呈清亮無色液體。用于原核表達(dá)系統(tǒng)，使其表達(dá)量增高，產(chǎn)物穩(wěn)定。此 處IPTG作為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)IFN-ε基因的表達(dá)。
[0024]進(jìn)一步，步驟(3)中培養(yǎng)的具體過程為：挑菌于液體培養(yǎng)基中，于37°C溫度下、以 200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)16h后按照體積比1:100的比例擴(kuò)培，向培養(yǎng)基中加入卡那霉素(Kan)、氯 霉素和L-阿拉伯糖，使其在培養(yǎng)基中的濃度分別為20yg/mL、20yg/mL和0.5mg/ml，于37°C溫 度下、以200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)4h后，加入異丙基-β-D-硫代R比喃半乳糖苷，于16°C溫度下、以 200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24h。
[0025] 進(jìn)一步，經(jīng)過步驟(4)后得到的可溶性IFN-ε蛋白的純度在95%以上。
[0026]本發(fā)明的目的之二在于保護(hù)利用上述述制備方法得到的IFN-ε蛋白在多克隆抗體 中的應(yīng)用，制備得到的多克隆抗體為一些常見疾病如陰道炎、子宮內(nèi)膜癌等的檢測與預(yù)防 提供了更為方便的途徑和治療方法。
[0027]本發(fā)明的有益效果在于：
[0028]本發(fā)明解決了在體外大量表達(dá)IFN-ε蛋白時(shí)不能獲得可溶性、具備天然活性的 IFN-ε蛋白的難題，成功得到可溶性的IFN-ε蛋白，并制備成多克隆抗體，為深入研究IFN-ε 的生物學(xué)特性及其與陰道炎、宮頸癌等常見疾病的發(fā)病關(guān)系提供理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)保障。
【附圖說明】
[0029]圖1為實(shí)施例1的PCR擴(kuò)增IFN-ε基因電泳圖，其中，1、2、3為PCR產(chǎn)物條帶，Μ為 D2000DNA條帶；
[0030]圖2為實(shí)施例2的酶切反應(yīng)電泳圖，其中，1、2、3、4為IFN-ε基因酶切后條帶，5為pET40b質(zhì)粒酶切后條帶；
[0031]圖3為實(shí)施例3的IFN-ε基因和pET40b質(zhì)粒的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化結(jié)果圖；
[0032]圖4為實(shí)施3的測序結(jié)果與基因庫序列比對(duì)圖，其中，Query為基因庫序列，Sbjct為 測序結(jié)果；
[0033] 圖5為實(shí)施例4的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)IFN-ε蛋白SDS-PAGE電泳圖，其中，A為未加入分子 伴侶的表達(dá)IFN-ε蛋白，1、2為對(duì)照菌(不含IFN-ε基因）的菌體破碎后上清、菌體沉淀中蛋白 條帶;3、4為實(shí)驗(yàn)菌(含IFN-ε基因）的菌體破碎后上清、菌體沉淀中蛋白條帶。B為加入分子 伴侶的表達(dá)IFN-ε蛋白，1、2為實(shí)驗(yàn)菌(含IFN-ε基因）的菌體破碎后上清、菌體沉淀中蛋白條 帶；
[0034]圖6為實(shí)施例5的純化后的IFN-ε蛋白SDS-PAGE電泳圖，其中，1為純化后的IFN-ε蛋 白，2為雜蛋白；
[0035]圖7為實(shí)施例6的WesternBlot鑒定結(jié)果，其中，1、2為兩個(gè)重復(fù)樣品。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 所舉實(shí)施例是為了更好地對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行說明，但并不是本發(fā)明的內(nèi)容僅限 于所舉實(shí)施例。所以熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
對(duì)實(shí)施方案進(jìn)行非本質(zhì)的改 進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0037] 實(shí)施例1PCR擴(kuò)增
[0038] (1)特征性引物的設(shè)計(jì)
[0039] 根據(jù)已知的人IFN-ε基因，使用PrimerPremier6.0軟件設(shè)計(jì)特性擴(kuò)增引物，引物 委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。最優(yōu)的PCR擴(kuò)增引物詳見表1。
[0040] 表1人IFN-ε基因擴(kuò)增引物
[0042] (2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)
[0043]PCR反應(yīng)各組分及相應(yīng)體系為：10XExBuffer(含Mg2+)5yLul;dNTP4yL;上游擴(kuò)增 引物lyL;反向引物lyL;ExTaq酶0 · 3yL;DNA模板2yL;加滅菌高純雙蒸水至50yL。
[0044]PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為:先于94°C溫度下預(yù)熱5min;以94°C溫度下變性30s、58°C溫 度下退火30s、72°C溫度下延伸1.5min為一個(gè)循環(huán)，共循環(huán)33次;在72°C溫度下處理lOmin。
[0045] 結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收目的基因條帶，在大約565bp處切膠回收。 電泳圖如圖1所示，其中，1、2、3為PCR產(chǎn)物條帶，Μ為D2000DNA條帶。
[0046] 實(shí)施例2酶切和連接
[0047] 將回收到的PCR產(chǎn)物及pET40b質(zhì)粒同時(shí)用ΝΕΒ公司的EcoRI和Xhol雙酶切，于37°C 溫度下反應(yīng)2h，電泳切膠回收。電泳圖如圖2所示，其中，1、2、3、4為IFN-ε基因酶切后條帶，5 為pET40b質(zhì)粒酶切后條帶。
[0048] 回收酶切后的IFN-ε基因和pET40b質(zhì)粒，按照IFN-ε基因和pET40b質(zhì)粒以體積比 15:2的比例在NEB公司的T4DNA連接酶的作用下，室溫下連接30min。