一種大鼠胚胎干細胞高效培養(yǎng)基的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)基，尤其是涉及一種大鼠胚胎干細胞高效培養(yǎng)基。
【背景技術】
[0002] 大鼠胚胎干細胞具有極其重要的科研價值。而大鼠胚胎干細胞的培養(yǎng)方法由 Austin Smith與應其龍等于2008年所發(fā)明。最早的大鼠胚胎干細胞培養(yǎng)基主要依靠 "3i"抑 制劑體系：CHIR99021，PD184352和SU5402。隨后，隨著研究的深入，應其龍又將"3i"大鼠胚 胎干細胞培養(yǎng)體系優(yōu)化為"2i"培養(yǎng)體系:CHIR99021PD0325901。但是"2i"培養(yǎng)體系培養(yǎng)時 間較長，并且不容易獲得大型克隆，同時其穩(wěn)定性較差。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術存在的缺陷而提供一種效果穩(wěn)定、培養(yǎng) 周期短、可獲得大型克隆的大鼠胚胎干細胞高效培養(yǎng)基。
[0004] 本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案來實現(xiàn)：
[0005] -種大鼠胚胎干細胞高效培養(yǎng)基，每40ml的大鼠胚胎干細胞高效培養(yǎng)基包括以下 成分： DMEM/F12 培？'MG 20ml Neurobasal 培養(yǎng)基 2〇ml.， b-疏丨乙0? 1,65χ ΙΟ 8moK CHIR99021 1.2χ!0 7mo 1，
[0006] PD0325901 4>· i O'Vol, Ν-2添加劑 （) 2mh B-27 添加劑 0,4 ml， L-谷氨酰胺 2xlO'Viol，
[0007] 重組小鼠白血病抑制因子 4.14ul。
[0008] 所述的b -巰基乙醇是以D P B S為溶劑的溶液形態(tài)，且b -巰基乙醇溶液的濃度為 55mM〇
[0009] 所述的CHIR99021是以DMS0為溶劑的溶液形態(tài)，且CHIR99021溶液的濃度為10mM。
[0010] 所述的Η)0325901是以DMS0為溶劑的溶液形態(tài)，且Η)0325901溶液的濃度為10mM。
[0011] 所述的N-2添加劑為100倍濃度儲存液。
[0012]所述的B-27添加劑為無血清的50倍濃度儲存液。
[0013 ]所述的重組小鼠白血病抑制因子為1 〇7單位。
[0014]作為優(yōu)選，每40ml的大鼠胚胎干細胞高效培養(yǎng)基還包括以下成分:青鏈霉素雙抗 溶液0.5ml，所述的青鏈霉素雙抗溶液含5000單位青霉素和5000ug鏈霉素。青鏈霉素雙抗溶 液為防止細胞污染而加入，其本身對大鼠胚胎干細胞高效培養(yǎng)無顯著作用，可根據(jù)實際情 況決定是否添加。
[0015] 重組小鼠白血病抑制因子，即recombinant mouse Leukemia Inhibitory Factor (簡稱為mLIF，本培養(yǎng)基所使用重組小鼠白血病抑制因子為107單位）。
[0016] 培養(yǎng)基成分主要作用：
[0017] DMEM/F12培養(yǎng)基:此培養(yǎng)基可用來培養(yǎng)嚙齒類動物細胞，尤其適合對大鼠和兔子 細胞的培養(yǎng)，并被證明在骨髓瘤與雜交瘤細胞培養(yǎng)中可以使細胞處于高質量狀態(tài)。
[0018] N-2添加劑：主要用于成神經(jīng)細胞瘤以及周圍神經(jīng)系統(tǒng)（PNS)與中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS)的原代細胞培養(yǎng)。N-2添加劑可以替代Bottenstein中的N1添加劑，用于添加了生長因 子bFGF和EGF的Neurobasal培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基。
[0019] Neurobasal培養(yǎng)基：用于培養(yǎng)出生前和胎兒神經(jīng)元細胞。使用時需添加 B-27添加 劑。此培養(yǎng)基可用于海馬神經(jīng)元，大腦皮層和大腦其他區(qū)域的神經(jīng)細胞的生長。此外，該培 養(yǎng)基可以在不添加膠質細胞飼養(yǎng)層的情況下維持神經(jīng)細胞的同源群落存活。
[0020] B-27添加劑:是無血清添加劑，用于海馬神經(jīng)元和其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)神經(jīng)元 的生長。該培養(yǎng)基可以與Neurobasal培養(yǎng)基組合使用，在神經(jīng)細胞培養(yǎng)時省略了飼養(yǎng)層細 胞。
[0021] L-谷氨酰胺:主要用于細胞培養(yǎng)，可以作為原料合成嘌呤、嘧啶核苷酸，氨基糖，谷 胱甘肽以及谷氨酸，對于細胞生長非常重要。
[0022] b_巰基乙醇:可以促使胚胎干細胞分裂，提高獲取囊胚的質量。
[0023] CHIR99021:CHIR99021可以抑制GSK-3,使胞內游離β-catenin增加，激活經(jīng)典Wnt ?目號通路。
[0024] TO0325901:是非ΑΤΡ競爭性的ΜΑΡΚ激酶ΜΕΚ抑制劑。蘇氨酸/酪氨酸激酶ΜΕΚ是RAS/ RAF/MEK/ERK信號通路的關鍵組成部分，在胚胎干細胞增殖分化過程中具有重要作用。 PD0325901可精確有效地抑制ΜΕΚ。
[0025]重組小鼠白血病抑制因子:可以維持胚胎干細胞干性狀態(tài)。
[0026] 在配制培養(yǎng)基時首先將20ml DMEM/F12培養(yǎng)基與0.2ml Ν-2添加劑（100倍濃度儲 存液)配成混合液1。
[0027] 將20ml Neurobasal培養(yǎng)基與0.4ml B-27添加劑(無血清，50倍濃度儲存液）以及 L-谷氨酰胺4 X l(T5m〇l混勻制成混合液2 〇
[0028] 將20ml混合液1與20ml混合液2混勻后再加入1 · 65 X 10-8mol b-巰基乙醇，1 · 2 X 10-7mo 1 CHIR99021，4X10-8mol PD0325901。
[0029] 本發(fā)明培養(yǎng)基的使用方法:生長在飼養(yǎng)層細胞上的大鼠胚胎干細胞可直接添加此 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。添加量為2_3ml/孔（以6孔板為例），大約培養(yǎng)2-3天，根據(jù)細胞生長狀態(tài)進 行傳代或凍存。另外，本發(fā)明產品也可替代傳統(tǒng)2i培養(yǎng)基用于原代大鼠胚胎干細胞分離培 養(yǎng)。
[0030] 本發(fā)明制備的高效培養(yǎng)基可用于大量培養(yǎng)和擴增大鼠胚胎干細胞，為制備基于胚 胎干細胞基因修飾大鼠疾病模型、研究大鼠干細胞的自我更新和定向分化的分子機制以及 建立相關分化細胞模型提供了前提條件和基礎。
[0031] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點及有益效果：
[0032] 1、本發(fā)明對"2i"大鼠胚胎干細胞培養(yǎng)體系進行優(yōu)化，與傳統(tǒng)"2i"培養(yǎng)基相比將抑 制劑ro〇325901、CHIR99021的使用量提升了一倍，并加入了重組小鼠白血病抑制因子，降低 了傳統(tǒng)"2i"培養(yǎng)基中的β-巰基乙醇濃度。使用傳統(tǒng)"2i"培養(yǎng)基需要4-5天才可使大鼠胚胎 干細胞長到合適大小及密度，而使用本發(fā)明培養(yǎng)基需要2-3天即可長到相同密度，且單個干 細胞克隆要大于使用傳統(tǒng)"2i"培養(yǎng)基所培養(yǎng)的大鼠胚胎干細胞。
[0033] 2、使用本發(fā)明的培養(yǎng)基可獲得大型克隆：用該發(fā)明高效培養(yǎng)基可培養(yǎng)出平均直徑