一種固定線蟲單條蟲dna粗提液及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學檢測鑒定技術領域，具體涉及一種固定線蟲單條蟲DNA粗 提液及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002] 核酸的分離與純化是分子生物學研究中重要的技術，現有的DNA提取與純化方法 一般只適用于新鮮材料，雖然對于一些較為特殊材料的DNA提取已提出一些專一方法，但是 對于福爾馬林長期保存生物標本基因組DNA的提取至今未能徹底解決。作為生物標本的保 存液，福爾馬林的優(yōu)點在于滲透力強、防腐殺菌效果好、固定速度快，具有能快速殺死生物 細胞以固定生物大分子的功能。因此在過去的若干年中，世界各國生物學家采集了大量生 物標本并保存于福爾馬林中，這些標本在研究物種起源、系統(tǒng)進化、特定物種基因資源保護 以及生物多樣性等方面具有很高的學術研究價值。如不能正常提取基因組總DNA，就會給從 分子水平上比較研究這類生物帶來障礙(徐來祥等，2002)。對于線蟲研究來說，由于采集的 樣品多混合不同營養(yǎng)類型的線蟲（如自由生活和植物寄生線蟲），而且包含的種類也非常 多，所以，要先將樣品固定，再做形態(tài)鑒定將不同類群分開，才能做進一步的研究。
[0003] 對固定線蟲PCR擴增的研究報道不是很多。Thomas等（1997)曾對5%甲醛固定48h 的自由生活線蟲（Caenorhabditis elegans、Zeldia punctata、Aduncospiculum halicti) 的D2-D3擴展區(qū)進行了成功擴增，目的片段約<400bp;沈錫權等（2005)對丙酮、乙醇、乙醇+ 50mmol/L EDTA(pH8.0)和5 %海水福爾馬林等4種固定劑中對海洋線蟲18S核糖體RNA基因 進行了研究，發(fā)現用蛋白酶K法提取DNA可以擴增到約1.7kb的目的片段。對固定植物寄生線 蟲的研究報道更是很少，Rubtsova等(2005)對使用TAF(三乙醇胺:福爾馬林:蒸餾水= 2:7: 91)固定24h的植物寄生線蟲長針線蟲(Longidorus spp.)，以及該固定液固定后，脫水制成 永久玻片保存最長達11年的長針線蟲分別進行D2-D3擴展區(qū)PCR擴增，均成功擴增到約 200bp的目的片段。0〇1'1^8等(2002)在對用4%福爾馬林固定的人寄生線蟲（31：1'〇1^71丨(168 spp.)進行DNA提取時發(fā)現，對于新4%福爾馬林固定和酒精脫水保存在甘油中的標本使用 蛋白酶K裂解，可以從核糖體DNA小亞基（約1700bp長）中獲得約1000bp的片段;但對福爾馬 林固定保存10年后又酒精脫水保存在甘油玻片中的線蟲來說，同樣步驟則很難獲得，需要 使用更強的裂解方法，才能使線蟲表皮破裂，但也可以獲得目的片段。相似穿孔線蟲 (Radopholus similis(Cobb)Thorne，1949)是一種遷移性植物內寄生線蟲，已報道的寄主 植物超過250種(01&1111〇11，1977)，嚴重危害多種經濟植物和觀賞植物（（^^6丨 &1，1990; Richardson et al，1993;Uchida et al，2003;Sundararaju et al，1979)，是諸多國家的 重要檢疫危險性植物有害生物（Cotton J et al;0EPP/EPP0,2008)，也是中國禁止進境植 物檢疫性有害生物（中華人民共和國農業(yè)部，2007)。目前，隨著經濟及農業(yè)生產和農產品貿 易迅速發(fā)展，植物種苗等種植材料在國家和地區(qū)間調運的數量不斷增加，從而促使了相似 穿孔線蟲在世界廣泛的傳播。由于相似穿孔線蟲對作物為害所造成的損失非常大，所以需 要建立起一系列的檢測方法，來檢測該線蟲在我國的侵染情況。相似穿孔線蟲寄生植物根 系，在植物組織和土壤中均能生存完成生活史。由于土壤中線蟲種類較多，但植物線蟲數量 分布不均勻，所以每種種類分離到的可能較少，這對于缺乏形態(tài)學分類鑒定專門知識技能 的相關人員來說，難以根據形態(tài)學特征進行快速準確的屬種鑒定，一般都采取先殺死固定 保存，然后再逐步進行相關研究的程序。所以發(fā)明一種可以檢測固定植物線蟲的PCR檢測方 法對于植物線蟲種類鑒定具有重要意義。

【發(fā)明內容】

[0004] 為了克服現有技術的不足和缺點，本發(fā)明的首要目的在于提供一種固定線蟲單條 蟲DNA粗提液的制備方法。
[0005] 本發(fā)明的再一目的在于提供上述制備方法制備得到的固定線蟲單條蟲DNA粗提 液。
[0006] 本發(fā)明的再一目的在于提供上述固定線蟲單條蟲DNA粗提液的應用。
[0007]本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現：
[0008] 一種固定線蟲單條蟲DNA粗提液的制備方法，包含如下步驟：
[0009] (1)線蟲樣品的洗滌:將固定線蟲置于水中初步清洗，然后將線蟲轉至1XTE緩沖 液或1 XPBS緩沖液中，浸泡洗滌12h~24h;
[0010] (2)固定線蟲樣品的裂解:將步驟（1)洗滌后的單條固定線蟲置于6yL~10yL裂解 液中，并將線蟲刺破，得到固定線蟲和裂解液的混合物;然后將混合物迅速凍結；
[0011] (3 )DNA粗提液的制備:將步驟(2)中凍結后的固定線蟲和裂解液的混合物在95°C ~99°C的條件下處理5min~lOmin;然后加入蛋白酶K除蛋白，得到固定線蟲單條蟲DNA粗提 液；
[0012] 步驟（1)中所述的固定線蟲的固定液為包含福爾馬林、甘油和水的FG固定液，其 中，福爾馬林、甘油和水的體積比為10:1:89;
[0013]步驟（1)中所述的1 X TE緩沖液包含如下質量百分比計的組分:Tris堿1.211 %， Na2EDTA 0.3722 %，水補足100 %;所述的IX TE緩沖液的pH值為8.0;
[0014]步驟（1)中所述的1 X PBS緩沖液包含如下組分:終濃度為137mM的NaCl、終濃度為 2.7mM的KC1、終濃度為10mM的Na2HP〇4和終濃度為2mM的KH2P〇4;
[0015]步驟（1)中所述的固定線蟲采用1 X PBS緩沖液浸泡洗滌時，優(yōu)選用1 X PBS緩沖液 浸泡洗滌2h后，重新更換新鮮PBS緩沖液再次浸泡洗滌12h~24h;
[0016]步驟(1)中所述的凍結的溫度優(yōu)選為不超過-80°C;
[0017]步驟(2)中所述的裂解液包含如下組分:終濃度為10mM的Tris、終濃度為2.5mM的 MgCl2和終濃度為50mM的KC1以及體積百分比為0.45%的TWEEN 20和質量百分比為0.05% 的gelatin;所述的裂解液的pH值為8.2;
[0018] 步驟(2)中所述的蛋白酶K的工作濃度優(yōu)選為400~500yg/mL;
[0019] 步驟(2)中所述的除蛋白的條件優(yōu)選為65°C處理60min，然后95°C處理lOmin;
[0020] 一種固定線蟲單條蟲DNA粗提液通過上述方法制備得到；
[0021] 所述的固定線蟲單條蟲DNA粗提液在線蟲檢測鑒定領域中的應用；
[0022] 所述的固定線蟲單條蟲DNA粗提液在線蟲檢測鑒定領域中的應用，優(yōu)選包含如下 步驟：
[0023] (1)以上述固定線蟲單條蟲DNA粗提液為模板，設計線蟲特異性引物，進行PCR擴 增；
[0024] (2)對步驟(1)得到的PCR擴增產物進行分析，確定線蟲的種類；
[0025]所述的PCR擴增的體系優(yōu)選為25yL反應體系，具體如下所示： 上述固定線蟲單條蟲DNA粗提液 2μ^, 2XPCR buffer 12.5 pL；
[0026] 2 mM dNTP 5 ^L； 聚合酶 0.5 gL; 上游引物 0.8 pL;
[0027] 下游引物 0.8 pL; 水 補足25 μ_[;
[0028] 所述的的PCR擴增的條件優(yōu)選為：94°C預變性3min; 94°C30sec，55°C30sec，68°C lmin，共35個循環(huán);68°C延伸lOmin;
[0029] 所述的聚合酶優(yōu)選為高保真高擴增率酶KOD FX;
[0030] 所述的線蟲優(yōu)選為相似穿孔線蟲；
[0031] 所述的上游引物和下游引物優(yōu)選為：
[0032] 上游引物：5' -CTACAAATGTGACGCGAA-3' ；
[0033] 下游引物：5' -CAATCTGCACAATGAACATAC-3' ；
[0034]本發(fā)明相對于現有技術具有如下的優(yōu)點及效果：
[0035] 目前對于固定線蟲PCR的報道并不多，而已有的報道多是對福爾馬林新固定的線 蟲，且多數擴增片段較短，一般小于400bp，而對于固定植物