卡巴他賽免疫原、特異性抗體和檢測試劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，涉及卡巴他賽免疫原、特異性抗體和檢測試劑及其制 備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 卡巴他賽(Cabazitaxel)結(jié)構(gòu)式如式（ΙΠ )所示：
[0004] 卡巴他賽，別名：70，1〇少二甲氧基多西紫杉醇，化學(xué)名：（2€[，50，70，100，13€0-4-乙酰氧基 _ 13-[[(2R，3S)-3_[(叔丁氧幾基)氨基]_2_羥基_3_苯丙?；鵠氧基]-1 -羥基-7， 10-二甲氧基-9-氧代紫杉-5,20-環(huán)氧基-11-烯-2-苯甲酸酯，是一種化學(xué)半合成紫杉烷類 小分子抗腫瘤藥物，通過從紅豆杉中萃取的前體化合物半合成而來?？ò退愂嵌辔髯仙?醇的二甲氧基衍生物，通過對后者兩個羥基的甲氧基化，消除了其對多藥耐藥基因 MDRl編 碼的P-糖蛋白（P-gp)的親和力，而該蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞抵抗傳統(tǒng)紫杉 烷類化療藥物的經(jīng)典機(jī)制。作為一種微管抑制劑，卡巴他賽通過與微管蛋白結(jié)合，在促進(jìn)微 管二聚體裝配成微管的同時阻止微管的去多聚化過程，從而抑制微管分解，增加微管的穩(wěn) 定性，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，將腫瘤細(xì)胞阻滯于G2/M期，并促進(jìn)其凋亡，最終抑制 腫瘤組織的增殖。臨床上本品通常與潑尼松聯(lián)用，用于晚期轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者的化療。卡 巴他賽的血藥濃度與治療效果之間有著密切關(guān)系，低于有效血藥濃度達(dá)不到治療效果，高 于有效血藥濃度會導(dǎo)致嚴(yán)重的毒副作用。因此，快速、準(zhǔn)確、高通量、低成本的測定卡巴他賽 在腫瘤患者體內(nèi)的血藥濃度，對于降低毒副作用和提高患者生存率都具有重要意義。
[0005]目前，國內(nèi)外監(jiān)測卡巴他賽血藥濃度的主要方法是酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、高效 液相色譜法(HPLC)、反相高效液相色譜法(RP-HPLC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等 傳統(tǒng)方法，但這些方法都不能滿足高通量與低成本的臨床需求。目前市場上缺乏穩(wěn)定性好、 靈敏度高、特異性強(qiáng)的卡巴他賽檢測試劑，尤其是質(zhì)量好的自動化檢驗(yàn)試劑，因此，研發(fā)生 產(chǎn)質(zhì)量達(dá)到臨床要求、實(shí)用性強(qiáng)、性價比高，可應(yīng)用于全自動生化分析儀的卡巴他賽測定試 劑已成為國內(nèi)外體外診斷試劑行業(yè)的熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，采用卡巴他賽衍生物制備免疫原性強(qiáng)的卡 巴他賽免疫原及其抗體，并提供了一種操作簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng)的檢測試劑。應(yīng)用均 相酶免疫檢測技術(shù)實(shí)現(xiàn)在全自動生化分析儀上對卡巴他賽的測定，可以高通量、快速化、精 確地確定樣品中的卡巴他賽含量，且具有操作簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)， 有效降低卡巴他賽檢測成本，有利于臨床的個體化治療，適合臨床廣泛推廣使用。
[0007] 本發(fā)明的一個目的在于提供一種卡巴他賽衍生物的合成方法。
[0008] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種免疫原性強(qiáng)的卡巴他賽免疫原。
[0009] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種卡巴他賽免疫原的制備方法。
[0010] 本發(fā)明的另一個目的在于提供使用本發(fā)明卡巴他賽免疫原制備得到的特異性強(qiáng) 的抗卡巴他賽特異性抗體。
[0011] 本發(fā)明的又一個目的在于提供一種卡巴他賽檢測試劑。
[0012] 本發(fā)明的再一個目的是提供卡巴他賽檢測試劑的制備方法。
[0013] 免疫原性與所合成的卡巴他賽衍生物分子結(jié)構(gòu)及所選載體種類有關(guān)，現(xiàn)有技術(shù)中 卡巴他賽免疫原的免疫原性較弱，所得到抗體的特異性、與卡巴他賽的結(jié)合力，敏感度都不 如本發(fā)明。本發(fā)明的卡巴他賽免疫原，免疫原性高，可以誘導(dǎo)得到高效價的抗卡巴他賽特異 性抗體。該抗體特異性高，與卡巴他賽的結(jié)合力強(qiáng)。由該抗體制備得到的卡巴他賽檢測試 劑，可以快速、準(zhǔn)確地確定樣品中的卡巴他賽含量。
[0014] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下：
[0015] -種卡巴他賽免疫原，其結(jié)構(gòu)式如式⑴所示：
[0017] 式中，R為連接基團(tuán)-CO-(CH2)n-⑶0-，n是1至20之間的整數(shù)。優(yōu)選R為-CO-(CH 2)2-COO-〇
[0018]載體為具有免疫原性的蛋白質(zhì)或多肽，優(yōu)選為血清蛋白、血藍(lán)蛋白和甲狀腺球蛋 白。更優(yōu)選為牛血清白蛋白。
[0019] 卡巴他賽免疫原的合成途徑和方法如下：
[0020] 1.卡巴他賽衍生物的制備方法：
[0021 ] -種卡巴他賽衍生物，其結(jié)構(gòu)式如式（Π )所示：
[0023] 式中，R為連接基團(tuán)-CO-(CH2)n-COO-, η是1至20之間的整數(shù)。
[0024]上述卡巴他賽衍生物的合成路線及制備步驟如下：
[0026] (I)稱取0.5~2 . Og卡巴他賽、1.0~4. Og化合物A加入反應(yīng)體系中，然后用10~ 40ml吡啶或者干燥的苯在連續(xù)回流的玻璃燒瓶中進(jìn)行孵育。
[0027] (2)將此反應(yīng)混合物在70 - 80°C的回流溫度下持續(xù)加熱3~12小時，然后將反應(yīng)混 合物緩慢冷卻至室溫(可在室溫條件下讓其自行冷卻），輕輕倒去混合物上層的多余的吡啶 或苯。
[0028] (3)將剩余的有機(jī)成分在負(fù)壓條件下持續(xù)通入氮?dú)饬魇蛊湔舭l(fā)干燥，得到的干燥 殘留產(chǎn)物即為卡巴他賽衍生物。剩余的有機(jī)成分指的是反應(yīng)混合物去除吡啶或苯之后的成 分。
[0029] (4)將上述得到的產(chǎn)物用蒸餾水配制的60%乙醇沖洗5~20次以上，以獲得卡巴他 賽半琥珀酸脂(卡巴他賽衍生物)的重結(jié)晶。60 %指的是體積份數(shù)，即乙醇體積為60份，蒸餾 水體積為40份。
[0030] (5)通過薄層色譜法(TLC)這一標(biāo)準(zhǔn)分析方法對最終產(chǎn)物的產(chǎn)率進(jìn)行定量分析，最 終合成得到的卡巴他賽半琥珀酸酯殘留物通過TLC實(shí)驗(yàn)顯示其相對迀移系數(shù)(Rf)大約為 0.1-0.15，然而作為對照的卡巴他賽顯示出更大的Rf值，大約為0.3-0.4。在標(biāo)準(zhǔn)合成反應(yīng) 中，終產(chǎn)物卡巴他賽衍生物的平均產(chǎn)率大約為97%。以上步驟（1)-(5)方法簡便，得到的卡 巴他賽衍生物純度高。
[0031]本發(fā)明中，卡巴他賽衍生物的制備過程的步驟(1)中的化合物A選用了丁二酸酐為 合成原料，故所得的最終產(chǎn)物卡巴他賽衍生物的鏈接基團(tuán)R為-CO - (CH2) 2 - COO -。當(dāng)η取其他 值時，選用其他含有3-22個碳原子的烷二酸或相應(yīng)的酸酐進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時，合成方法完全一致。 其中選用丁二酸酐時，η取值為2，碳原子個數(shù)為4個。
[0032] 2.卡巴他賽免疫原的合成：
[0033] (1)將載體蛋白100~30011^溶解于25~7511110.214!18.5的磷酸緩沖液中 ；
[0034] (2)將如下化學(xué)品加入到小燒杯中攪拌溶解：100~300mg本發(fā)明合成的卡巴他賽 衍生物、1.5~6ml二甲基甲酰胺、1.5~6ml乙醇、3.5~10.Oml 10mM，pH 5.0的磷酸鉀緩沖 液、100~300mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亞胺、25~75mg N-羥基硫代琥珀酰亞胺， 將這些化學(xué)品在室溫下攪拌溶解反應(yīng)20~60min;
[0035] (3)將溶解好的溶液滴加至載體蛋白溶液中，并在2~8°C下攪拌過夜，得到抗原； 將合成好的抗原經(jīng)過透析進(jìn)行純化，得到卡巴他賽免疫原。
[0036]本發(fā)明中當(dāng)η取1~20范圍內(nèi)的其他整數(shù)時，用上述方法可以制備出如式（I)所示 的卡巴他賽免疫原。載體仍為具有免疫原性的蛋白質(zhì)，可以是血清蛋白，血藍(lán)蛋白和甲狀腺 球蛋白。優(yōu)選的，載體為血清蛋白。更優(yōu)選的，載體為牛血清白蛋白。
[0037]本發(fā)明中提供的連接基團(tuán)R為-CO-(CH2)n-C00-，免疫原性強(qiáng)弱與所合成的卡巴他 賽衍生物分子結(jié)構(gòu)，連接基團(tuán)的結(jié)構(gòu)及所選載體種類有關(guān)，本發(fā)明連接基團(tuán)的選取也具有 增加免疫原性的作用，但是η取1至20之間的任意整數(shù)時，使用不同η值的卡巴他賽衍生物制 備的卡巴他賽免疫原均具備強(qiáng)免疫原性，都能制備高效價的特異性抗體。
[0038]本發(fā)明的抗卡巴他賽特異性抗體，由上述的卡巴他賽免疫原免疫實(shí)驗(yàn)動物后產(chǎn)生 得到，制備的具體步驟如下：
[0039] (1)用PBS將上述合成的卡巴他賽免疫原稀釋至1.0mg/ml，得到抗原溶液，然后用 0.5~2. Oml抗原溶液與弗氏完全佐劑混合，對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行注射。
[0040] (2)2~3周后，再用0.5~2.Oml相同的抗原溶液與弗氏不完全佐劑對上述實(shí)驗(yàn)動 物注射一次，之后每隔四周注射一次，共計注射3~6次。
[0041 ] (3)對上述實(shí)驗(yàn)動物取血，分離純化得到效價為1:30000~1:50000的抗卡巴他賽 特異性抗體。
[0042]本發(fā)明的抗卡巴他賽特異性抗體為完整的抗體分子，也包括保留與卡巴他賽特異 性結(jié)合能力的抗體片段或抗體衍生物。本發(fā)明的抗體是多克隆抗體也可以是單克隆抗體， 優(yōu)選為多克隆抗體。
[0043]本發(fā)明的抗體為采用單一的卡巴他賽免疫原對動物加強(qiáng)免疫所獲得的多克隆抗 體，或者為免疫后經(jīng)體細(xì)胞雜交獲得的單克隆抗體;所述的實(shí)驗(yàn)動物為兔、山羊、小鼠、綿 羊、豚鼠或馬的一種，優(yōu)選為兔。
[0044] 本發(fā)明提供一種卡巴他賽檢測試劑，含有上述抗卡巴他賽特異性抗體和指示試 劑。
[0045] 本發(fā)明指示試劑選自酶試劑、放射性同位素試劑、熒光試劑、發(fā)光試劑。優(yōu)選的，指 示試劑為酶試劑，由卡巴他賽酶標(biāo)偶聯(lián)物和酶底物所組成。
[0046]上述酶標(biāo)偶聯(lián)物為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標(biāo)偶聯(lián)物;上述酶底物為葡萄 糖-6 -磷酸。所述半抗原為卡巴他賽衍生物。
[0047]卡巴他賽均相酶免疫檢測試劑在使用之前，為了避免指示試劑中的酶標(biāo)偶聯(lián)物和 酶的底物發(fā)生反應(yīng)，酶標(biāo)偶聯(lián)物和酶的底物是不混合的且分開放置，所以將酶的底物與上 述抗卡巴他賽特異性抗體混合在一起。因此，卡巴他賽均相酶免疫檢測試劑包括兩類試劑： [0048] (1)試劑A由抗卡巴他賽特異性抗體和均相酶底物混合而成，具體制備步驟如下：
[0049] 1)將2.0~6. Og氧化態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、1.0~3 . Og葡萄糖-6-磷 酸(G-6-P)用0.5~2L 55mM、pH=8.0的Tris緩沖液