Hav病毒樣顆粒的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種含有甲肝病毒HAV5’-UTR基因的病毒樣顆粒的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]甲型肝炎病毒是1973年Feinslone首先用免疫電鏡技術(shù)在急性期患者的糞便中發(fā)現(xiàn)甲型肝炎病毒(Hapatitis A virus,HAV )。屬微小RNA病毒科，新型腸道病毒72型，是一種常見的食源性疾病病毒，HAV對(duì)外界抵抗力較強(qiáng)，耐酸堿，室溫下可生存I周，干糞中25°C能生存30天。人類感染HAV后，大多表現(xiàn)為亞臨床或隱性感染，少數(shù)人表現(xiàn)為急性甲型肝炎，嚴(yán)重危害人民群眾健康。甲肝病毒呈全世界分布，我國作為高發(fā)區(qū)之一，其發(fā)病率十分高。甲肝病毒主要通過食物傳播，當(dāng)人們生食含有甲肝病毒的食物時(shí)，極有可能因感染病毒而誘發(fā)甲型肝炎。美國曾經(jīng)出現(xiàn)因食用凍草莓引起的甲肝暴發(fā)事件。因此，食品中甲肝病毒的快速檢測對(duì)于保障公共衛(wèi)生安全非常重要。
[0003]目前，食品中HAV檢測的常用方法有RT-PCR技術(shù)和熒光定量RT-PCR技術(shù)，為了保證檢測的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)中必須設(shè)立陽性對(duì)照或質(zhì)控品。通常使用病毒培養(yǎng)物或是由RNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA做標(biāo)準(zhǔn)品，但是前者存在生物安全的隱患且易被核糖核酸酶降解，后者不能體現(xiàn)核酸提取過程和反轉(zhuǎn)錄對(duì)試驗(yàn)的影響。本發(fā)明采用Armored RNA技術(shù)，構(gòu)建包裹甲肝病毒基因的假病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品，此假病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品能夠避免核糖核酸酶對(duì)RNA的降解，作為質(zhì)控品可以對(duì)從核酸提取至RT-PCR檢測的全過程進(jìn)行有效的監(jiān)控。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:構(gòu)建包裹甲肝病毒基因的假病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品，此假病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品能夠避免核糖核酸酶對(duì)RNA的降解，作為質(zhì)控品可以對(duì)從核酸提取至RT-PCR檢測的全過程進(jìn)行有效的監(jiān)控。
[0005]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題，將編碼組氨酸標(biāo)簽序列插入MS2噬菌體編碼外殼蛋白的β發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)序列中，構(gòu)建含有重組組氨酸標(biāo)簽的MS2噬菌體外殼蛋白和表達(dá)成熟酶蛋白基因的pNH-MS2his重組質(zhì)粒。并通過RT-RCR技術(shù)擴(kuò)增說￥基因，將其克隆于?冊(cè)-1^21118中，構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒pNH-MS2his-HAV。并將其轉(zhuǎn)化于表達(dá)大腸桿菌BL21 (DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果表明，表達(dá)的重組蛋白能夠自主裝配形成VLPs，而且其中含有HAV的基因RNA序列，并且該RNA序列具有良好的穩(wěn)定性，可以作為RNA病毒檢測時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品用于臨床及樣品檢測。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
本發(fā)明設(shè)計(jì)了一組擴(kuò)增HAV5 ’ -UTR基因引物，序列如下:
HAV-UTRfI:ATACCTCACCGCCGTTTGCCTAGGCTA；
HAV-UTRrI:AAGAATGAGGAAAAACCTAAATGCC；
5‘端和3’端分別加上Hind III和Not I酶切位點(diǎn)。
[0007]本發(fā)明提供一種pNH_MS2his重組質(zhì)粒，pNH_MS2his重組質(zhì)粒中插入的的HAV5’-UTR基因片段序列如下:
TCACCGCCGTTTGCCTAGGCTATAGGCTAAATTTTCCCTTCCCTGTCCTTCCCCTATTTCCCCTTGTTTTGTT
TGTAAATATTAATTCCTGCAGGTTCAGGGTTCTTTAATCTGTTTCTCTATAAGAACACTCAATTTTCACGCTTTCTG
TCTTCTTTCTTCCAGGGCTCTCCCCTTGCCCTAGGCTCTGGCCGTTGCGCCCGGCGGGGTCAACTCCATGATTAGCA
TGGAGCTGTAGGAGTCTAAATTGGGGACGCAGATGTTTGGGACGTCGCCTTGCAGTGTTAACTTGGCTCTCATGAAC
CTCTTTGATCTTCCACAAGGGGTAGGCTACGGGTGAAACCTCTTAGGCTAATACTTCTATGAAGAGATGCCTTGGAT
AGGGTAACAGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGACAAAAACCATTCAACGCCGGAGGACTGGCTCTCATCCAGTG
GATGCATTGAGTGAATTGATTGTCAGGGCTGTCTCTAGGTTTAATCTCAGACCTCTCTGTGCTTAGGGCAAACACTA
TTTGGCCTTAAATGGGATCCTGTGAGAGGGGGTCCCTCCATTGACAGCTGGACTGTTCTTTGGGGCCTTATGTGGTG
TTTGCCTCTGAGGTACTCAGGGGCATTTAGGTTTTTCCTCATo
[0008]本發(fā)明還提供一種制備含有HAV5，-UTR基因的HAV病毒樣顆粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的方法，包括下列步驟:
(I)含有組氨酸標(biāo)簽的VLPs重組質(zhì)粒pET-NH-MS2his的構(gòu)建
將pET32a質(zhì)粒使用Xba I和Nco I消化，去除其中的Xba I和Nco I兩個(gè)酶切位點(diǎn)間的序列，將人工合成的 5 ’ -P04-CTAGATTACAAGGC-3 ’ 和 5 ’ -P04-CATGGCCTTGTAAT-3 ’ 兩條互補(bǔ)的寡核苷酸復(fù)性后插入其中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-NH，測序鑒定；
采用一步法擴(kuò)增試劑盒以MS2Pfl和MS2Prl為引物，以MS2 RNA為模板擴(kuò)增MS2目的片段;擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒回收目的片段，用50yL ddH20洗脫，標(biāo)記為MS2 DNA ；
采用OneStep RT-PCR，以得到的MS2 DNA為模板，分別用引物MS2Pfl和ms2hispr以及ms2hispf和MS2Prl擴(kuò)增MS2上和MS2下2個(gè)DNA片段;擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用膠回收試劑盒回收后，存于4°C備用;再以2個(gè)片段的混合物為模板，以MS2Pfl和MS2Prl為引物做PCR，得到引入了編碼組氨酸標(biāo)簽序列的MS2 DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收后的PCR產(chǎn)物命名為MS2his;
分別將制備的pET-NH載體和回收的MS2his片段用限制性內(nèi)切酶BamHI和Hind ΙΠ進(jìn)行酶切消化;將雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用膠回收試劑盒回收后與PET-NH載體用Solut1nI連接酶進(jìn)行連接;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落作進(jìn)行酶切鑒定;從平板培養(yǎng)基上挑選單菌落接種至5 ml的含有Amp抗生素的液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)，參照質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行質(zhì)粒提取；以提取的質(zhì)粒為模板，以MS2Pf和MS2Pr為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測；若可見載體與I 700bp的MS2目的片段即為陽性。
[0009 ] (2)構(gòu)建含有HAV5 ’ UTR的原核表達(dá)載體pNH_MS2h i s
按RNA提取試劑盒說明書的方法提取HAV總RNA為模版，以HAV-UTRfl和HAV-UTRrl為引物，擴(kuò)增HAV5’-UTR蛋白基因，RT-PCR體系為:5 XRT-PCR buffer 5yL，dNTP mix IyL,Enzyme Mix lyL，引物NF和NR各lyL，RNA模板5yL，ddH20補(bǔ)足25 yL，反應(yīng)條件為，50°C反轉(zhuǎn)錄30min，95°C滅火變性lOmin，然后95°C lmin，55°C lmin，72°C I min，40個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10 min ；擴(kuò)增產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳，可見660bp條帶，寶生物凝膠回收試劑盒回收HAV5’-UTR蛋白片段。
[0010] Hindm和NotI雙酶切pNH-MS2his和HAV5’-UTR蛋白片段，膠回收試劑盒回收酶切的pNH-MS2his和HAV5 ’-UTR蛋白片段，回收產(chǎn)物16°C連接過夜;連接體系為載體pNH-MS2his和HAV-UTR蛋白片段分別為2 yL和6 yL，T4 DNA連接酶I yL，1XT4連接酶buffer I yL;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，將涂板后獲得的重組克隆進(jìn)行PCR鑒定;將陽性克隆菌種送測序，鑒定為陽性的重組載體命名為pNH-MS2his-HAV5，-UTR ；
(3)誘導(dǎo)及純化重組pNH-MS2his-HAV5’UTR質(zhì)粒
將測序正確的pNH-MS2his-HAV5 ’-UTR質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21 (DE3)，將陽性克隆菌株接種于氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D600=0.6，加入IPTG至終濃度為Immol/L，誘導(dǎo)表達(dá)6 h;離心收集菌體;菌體中加入裂解緩沖液重懸，于冰上放置30min，離心去除菌體碎片，將上清加入預(yù)裝有N1-NTA的純化柱中，使液體自然流出，加入3倍柱體積的洗滌緩沖液洗滌2次，然后加入洗脫緩沖液將病毒樣顆粒洗脫，命名為HAV5 ’ -UTR-VLPs。
[0011]為了檢測HAV，針對(duì)HAV的UTR基因，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種鑒定引物和探針，序列如下: 正向引物 HAV-F: 5 ’ -TCACCGCCGTTYGCCTAG-3 ’
反向引物 HAV-R: 5，-GGGGAGAGCCCTGGAAGAAAG-3，
探針HAV-P: 5 ’ -FAM-CCTGAACYYGCAGGAATYAA-MGB-BHQ-3 ’。
[0012]本發(fā)明中涉及的MS2及其相應(yīng)的引物都是本領(lǐng)域公知的，并且已經(jīng)商業(yè)化的生物材料。
[0013]本發(fā)明的有益效果為:(I)高效便利:按照本發(fā)明方法能夠高效、便利的得到含有HAV5’UTR-UTR片段病毒樣顆