一種檢測tpmt基因*3c多態(tài)性的引物與方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測技術領域，尤其設及一種檢測TPMT基因*3C多態(tài)性的引物與 方法。
【背景技術】
[0002] 琉嚷嶺類藥物屬于抑制嚷嶺合成途徑的細胞周期特異性藥物，能競爭性抑制次黃 嚷嶺轉變，阻礙DNA合成，抑制淋己細胞增殖，是臨床上常用于白血病、實體腫瘤的抗癌治療 和器官移植后的免疫抑制治療的藥物。在急性淋己細胞白血病(A化)的治療和改善預后中， 琉嚷嶺類藥物發(fā)揮了重要的作用，已有研究顯示A化治療方案中含琉嚷嶺的維持治療是減 少復發(fā)和提高無病生存率的重要環(huán)節(jié)。同時，現(xiàn)有研究也表明，治療A化的抗嚷嶺代謝藥 物一6-琉基嚷嶺(6-MP)和6-琉代鳥嚷嶺(6-TG)等均是無內在生物活性的藥物，必須通過體 內一系列代謝后才能發(fā)揮其抗白血病效應。琉嚷嶺甲基轉移酶(TPMT基因編碼)是琉嚷嶺代 謝過程的關鍵酶之一，能利用S-腺巧-心甲硫氨酸（SAM)作為甲基的供體和底物結合，特異 地催化雜環(huán)類和芳香類化合物苯環(huán)6-位硫原子甲基化而使其轉變成具有生物活性的中間 產物。琉嚷嶺甲基轉移酶活性缺乏者，琉嚷嶺轉化率降低，使用標準劑量的琉嚷嶺治療可能 會導致嚴重的毒副反應。
[0003] 關于TPMT的研究結果發(fā)現(xiàn)，琉嚷嶺甲基轉移酶活性降低或缺乏與其等位基因多態(tài) 性密切相關，目前已發(fā)現(xiàn)18種可能會引起琉嚷嶺甲基轉移酶活性降低的TPMT單核巧酸多態(tài) 性（SNPs)位點，對不同人種進行的研究發(fā)現(xiàn)，TPMT基因巧、TPMT基因*3B和TPMT基因*3C運3 個TPMT基因多態(tài)性位點最為常見，其余的則比較罕見。TPMT活性缺乏的患者服用標準計量 琉嚷嶺后藥物在體內代謝障礙，將會導致較為嚴重的琉嚷嶺相關毒副作用，因此使用琉嚷 嶺治療相關疾病的過程中，建議篩查使用琉嚷嶺患者的TPMT基因類型，W指導臨床琉嚷嶺 藥物劑量的調整。
[0004] 中國專利CN101333560公開了一種嚷嶺類藥物敏感基因忍片檢測試劑盒，可用于 檢測TPMT基因的TPMT基因巧、TPMT基因*3B和TPMT基因*3C多態(tài)性位點，但基因忍片的設計 成本高，檢測費用昂貴，而且其敏感度不高，檢測結果的可重復性差?，F(xiàn)有技術中缺少一種 檢測特異性和靈敏度高、準確性和精密性好、可實現(xiàn)TPMT基因*3C多態(tài)性檢測的檢測引物及 其方法。

【發(fā)明內容】

[0005] 為解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供一種檢測TPMT基因*3C多態(tài)性的引物 與方法，具有檢測特異性和靈敏度高，準確性和精密性好等優(yōu)點，實現(xiàn)了TPMT基因*3C多態(tài) 性的檢測。本發(fā)明檢測的位點為TPMT基因*3C(NM_000367.3:c.719A〉G，rsll42345)。
[0006] 本發(fā)明提供一種檢測TPMT基因*3C多態(tài)性的引物，包括PCR擴增引物和SNaPshot PCR引物；所述PCR擴增引物為上游引物5'- AATCCCTGATGTCATTCTTCATAGTATTT-3'（SEQ ID SNaPshotPCR引物為5'-TTTTTTTTTTTTTTGAATTGACTGTCTTTTTGAAAAGTTAT-3'（SEQID NO.3)。
[0007]采用上述技術方案，本發(fā)明提供的檢測ΤΡΜΤ基因*3C多態(tài)性的引物，可w實現(xiàn)ΤΡΜΤ 基因*3C的特異性檢測，準確性好。
[000引相應地，本發(fā)明還提供一種檢巧帥MT基因*3C多態(tài)性的方法，包括如下步驟： 51、 提取DNA樣品； 52、 W步驟S1所述的DNA樣本為模板，利用權利要求1中所述的PCR擴增引物進行多重 PCR擴增，并對擴增產物進行純化，； 53、 W步驟S2所述的純化后的PCR擴增產物為模板，利用權利要求1中所述的挪aPshot PCR引物進行SNaPshot PCR擴增，并對SNaPshot PCR擴增產物進行純化； 54、 采用毛細管電泳技術對步驟S3所述的純化后的SNaPsho巧CR擴增產物進行檢測，并 對檢測結果進行分析，確定SNP位點及其基因型。
[0009] 優(yōu)選地，所述步驟S1中的DNA樣品為邸TA抗凝外周血的DNA樣品。
[0010] 優(yōu)選地，所述步驟S2中的多重PCR擴增反應條件包括:98°C預變性3min，98°C變性 10s，58°C退火30s，72°C延伸Imin，進行29個循環(huán)，最后72°C延伸5min，結束后25°C保溫。
[0011] 優(yōu)選地，所述步驟S3中的挪aPshot PCR擴增反應條件包括:96°C變性10s，55°C退 火5s，60°C延伸30s，進行25個循環(huán)，結束后4°C保溫。
[0012] 優(yōu)選地，所述步驟S4中，采用GE肥MAP陽RID V4.1軟件對檢測結果進行分析。
[001引此外，本發(fā)明還提供檢測TPMT基因*3C多態(tài)性的引物在制備檢測TPMT基因*3C多態(tài) 性試劑中的用途。
[0014]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明提供了一種檢測TPMT基因*3C多態(tài) 性的引物，該引物的特異性好，可實現(xiàn)TPMT基因*3C的特異性檢測，準確性好，檢測效率高。 此外，本發(fā)明還提供了一種檢測TPMT基因*3C多態(tài)性的測aPshot法，通過使用特異性的PCR 擴增引物和S化Pshot PCR引物，具有特異性好、靈敏度高、準確性和精密性好等優(yōu)點，檢測 結果可用于嚷嶺類化療藥物個體化用藥的臨床指導。
【附圖說明】
[001引圖1本發(fā)明提供的TPMT基因*3巧I物的部分擴增片段。
[0016]圖2本發(fā)明提供的TPMT基因*3巧I物擴增產物的部分測序圖。
[00Π ]圖3樣品的TPMT基因*3C檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0018] W下內容是結合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定 本發(fā)明的具體實施只局限于運些說明。對于本發(fā)明所屬技術領域的普通技術人員來說，在 不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可W做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發(fā)明的 保護化圍。
[0019] 實施例一引物 發(fā)明人針對TPMT基因*3C的多態(tài)性位點，設計了大量引物，通過引物反應條件的優(yōu)化和 比較，篩選出了特異性好的引物。本發(fā)明提供的引物如表1所示。本發(fā)明提供的所有引物序 列均通過UCSC數(shù)據(jù)庫比對，無已知SNP位點。
[0020] 實施例二引物的特異性 將本發(fā)明提供的TPMT基因*3巧I物于UCSC中進行Blast,結果如下:TPMT基因*3訝廣增片 段位于C虹6:18130816-18131066。了?11'基因*3巧寺異引物的擴增片段及基因組位置如圖1所 示，引物的擴增片段覆蓋了相應的檢測位點TPMT基因*3C，無其它同源基因。
[0021 ]使用表1中PCR擴增引物分別對檢測樣品DNA進行擴增及Sanger測序，部分測序結 果如圖2所示。測序結果顯示，引物擴增片段與TPMT基因*3C基因參考序列吻合。TPMT基因* 3C基因參考序列號為TPMT:NG_012137.2 ;NM_000367.3。
[0022] 使用表1中測aPshot PCR引物，S化Pshot法進行檢測，部分結果如圖3所示。從圖3 可知，產物峰的相對位置及測序反應滲入的堿基與預期相符，無其它干擾峰。
[0023] 實施例Ξ TPMT基因*3C多態(tài)性的檢測 1、提取抓TA抗凝外周血的DNA樣品，提取方法參照TIANamp Blood