棘白菌素b的提取純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種提取純化方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種棘白菌素B的提取純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]20世紀(jì)70年代，人類(lèi)首次發(fā)現(xiàn)了具有抑制真菌細(xì)胞壁合成物質(zhì)一一棘白菌素類(lèi)化合物，酰胺、絲氨酸、蘇氨酸和鳥(niǎo)氨酸，不同的氨基酸以及脂肪酸側(cè)鏈導(dǎo)致了棘白菌素類(lèi)藥物的化學(xué)多樣性。棘白菌素B的開(kāi)發(fā)具有較好的市場(chǎng)前景。但由于其生產(chǎn)難度較高，純化難度大。
[0003]真菌感染疾病，尤其是深部真菌感染疾病的發(fā)病率和致死率逐年增加，因此抗真菌藥物的研發(fā)將會(huì)成為人類(lèi)面臨的一個(gè)難題。棘白菌素類(lèi)藥物是20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)的一組天然產(chǎn)物，由相似的環(huán)狀多肽核心和不同的脂肪酸側(cè)鏈組成，通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)性作用抑制細(xì)胞壁中B.(I，3) — D—葡聚糖的合成，而發(fā)揮其抗真菌作用。棘白菌素類(lèi)藥物具有作用機(jī)制獨(dú)特，不良反應(yīng)率低，且對(duì)一些唑類(lèi)和兩性霉素B耐藥的真菌具有很強(qiáng)的抗菌活性等特點(diǎn)。
[0004]對(duì)棘白菌素B的分離有比較大的難度，先前用各種方法分離到的棘白菌素B的純度都不高，US6506726將發(fā)酵液酸化以后使用HP20、SP825、SP207等大孔樹(shù)脂分離純化棘白菌素B，但是該方法分離到的產(chǎn)物的純度低，產(chǎn)品含量最多只能到80%左右，不符合目前市場(chǎng)上對(duì)該產(chǎn)品的要求。US4288549中采用了硅膠層析、萃取等方法得到棘白菌素B的方法，但是該方法采用了壓力柱，而且對(duì)色素的分離也比較難，同樣導(dǎo)致純度不高。國(guó)內(nèi)公開(kāi)號(hào)為CN103724403A的專(zhuān)利，提供了另外一種從發(fā)酵液中分離棘白菌素B的方法，該方法通過(guò)發(fā)酵提取，同樣也是從反向硅膠中分離純化，但該方法步驟非常長(zhǎng)，操作繁瑣，導(dǎo)致對(duì)棘白菌素B的提取率比較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問(wèn)題，并提供至少后面將說(shuō)明的優(yōu)點(diǎn)。
[0006]本發(fā)明還有一個(gè)目的是提高棘白菌素B產(chǎn)品的提取率和產(chǎn)品純度，降低生產(chǎn)成本。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種棘白菌素B的提取純化方法，包括如下步驟:
[0008]步驟一、酸化棘白菌素B的發(fā)酵液，過(guò)濾獲得菌絲體濾液；
[0009]步驟二、將步驟一得到的菌絲體濾液通過(guò)以濃縮分離超濾膜為組件的超濾設(shè)備，調(diào)節(jié)溫度為25?30°C，壓力為1.1?1.9MPa，流速為3.0?5.0L/h進(jìn)行濃縮，得到分離后的透過(guò)液；
[0010]步驟三、將步驟二得到的透過(guò)液通過(guò)以鈉濾膜為組件的超濾設(shè)備，調(diào)節(jié)溫度為25?30°C，壓力為I.I?I.9MPa，流速為I.0?3.0L/h進(jìn)行濃縮，得到濃縮液；
[0011 ]步驟四、用凝膠柱將步驟三得到的濃縮液進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，收集洗脫液，得到棘白菌素B的粗品；
[0012]步驟五、將步驟四得到的棘白菌素B的粗品重結(jié)晶、加熱回流和冷卻干燥后，得到棘白菌素B的純品。
[0013]采用對(duì)發(fā)酵液提取、超濾大分子、鈉濾小分子、凝膠柱分離、重結(jié)晶、加熱回流和冷卻干燥，得到棘白菌素B的純品，操作簡(jiǎn)單方便，降低了生產(chǎn)成本。同時(shí)，操作提取過(guò)程在較低溫度下進(jìn)行，對(duì)棘白菌素B無(wú)破壞作用，不會(huì)產(chǎn)生多余雜質(zhì)，提高了產(chǎn)品的收率及產(chǎn)品的質(zhì)量。
[0014]優(yōu)選的是，所述的棘白菌素B的提取純化方法中，所述步驟一中，棘白菌素B的發(fā)酵液用稀酸調(diào)節(jié)pH值為4.5?5.5，攪拌30?50min后，離心得到菌絲體，然后在菌絲體中加入3?7倍體積的乙醇，攪拌I?5小時(shí)，過(guò)濾后獲得菌絲體濾液。
[0015]優(yōu)選的是，所述的棘白菌素B的提取純化方法中，所述稀酸為稀鹽酸、稀硫酸、磷酸或醋酸中的任一種。
[0016]優(yōu)選的是，所述的棘白菌素B的提取純化方法中，所述稀酸為稀鹽酸。
[0017]優(yōu)選的是，所述的棘白菌素B的提取純化方法中，所述步驟三中，濃縮液中加入濃縮液I?4倍體積的乙醇，攪拌I?5小時(shí)，于-10?0°C下析出固體備用。
[0018]優(yōu)選的是，所述的棘白菌素B的提取純化方法中，所述步驟四中，將凝膠柱裝柱后，先用體積比為1:1的甲醇和水進(jìn)行一次洗脫，洗脫液回收，然后用體積比為5:1?2:1的甲醇和水進(jìn)行二次洗脫，流速為1.0?2.0L/h，收集洗脫液，將兩次的洗脫液回收置于20?50°C下濃縮至干，得到棘白菌素B的粗品。
[0019]優(yōu)選的是，所述的棘白菌素B的提取純化方法中，對(duì)凝膠柱進(jìn)行二次洗脫時(shí)，甲醇和水的體積比為3:1。
[0020]優(yōu)選的是，所述的棘白菌素B的提取純化方法中，所述步驟五中，向步驟四得到的棘白菌素B中加入6?10倍質(zhì)量的重結(jié)晶溶劑，加熱回流10?30min，冷卻降溫到O?4°C，過(guò)濾，30?40°C下真空干燥得到棘白菌素B的純品。
[0021]優(yōu)選的是，所述的棘白菌素B的提取純化方法中，所述重結(jié)晶溶劑為丁酮、甲苯、乙酸乙酯或乙腈中的任一種。
[0022]優(yōu)選的是，所述的棘白菌素B的提取純化方法中，所述重結(jié)晶溶劑為丁酮。
[0023]本發(fā)明至少包括以下有益效果:
[0024](I)根據(jù)發(fā)酵液發(fā)酵產(chǎn)物種類(lèi)多的特點(diǎn)，采用超濾分離、凝膠樹(shù)脂分離和重結(jié)晶法，并在較低溫度下進(jìn)行，污染小，提取時(shí)間短，棘白菌素B損失少，蛋白質(zhì)等雜質(zhì)溶出較少，有效提高了棘白菌素B的得率，整個(gè)工藝提取率達(dá)到76%以上。
[0025](2)利用鈉濾，簡(jiǎn)單方便的消除了發(fā)酵以及純化過(guò)程中產(chǎn)生的小分子雜質(zhì)，有利于產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程的提純。
[0026](3)在產(chǎn)品的分離純化過(guò)程中用凝膠柱進(jìn)行分離，進(jìn)一步精確分離，得到了高純度產(chǎn)品，純度不低于98 %。
[0027]本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過(guò)下面的說(shuō)明體現(xiàn)，部分還將通過(guò)對(duì)本發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。
【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1為本發(fā)明所述的棘白菌素B的提取純化方法的流程示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說(shuō)明書(shū)文字能夠據(jù)以實(shí)施。
[0030]應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術(shù)語(yǔ)并不配出一個(gè)或多個(gè)其它元件或其組合的存在或添加。
[0031 ]本發(fā)明提供了一種棘白菌素B的提取純化方法，包括如下步驟:
[0032]步驟一、酸化棘白菌素B的發(fā)酵液，過(guò)濾獲得菌絲體濾液。
[0033]步驟二、沖洗超濾設(shè)備、管道以及容器，將步驟一得到的菌絲體濾液裝入料液槽，并通過(guò)以GE4040濃縮分離超濾膜為組件的超濾設(shè)備，調(diào)節(jié)溫度為25?30°C，壓力為1.1?1.9MPa，流速為3.0?5.0L/h進(jìn)行濃縮，截留分子量3000以上的分子，得到分離后的透過(guò)液。
[0034]步驟三、將步驟二得到的透過(guò)液通過(guò)以DUracilNF4040鈉濾膜為組件的超濾設(shè)備，調(diào)節(jié)溫度為25?30°C，壓力為1.1?1.9MPa，流速為1.0?3.0L/h進(jìn)行濃縮，截留分子量500以上的分子，得到濃縮液。
[0035]步驟四、用Sephadex LH-20凝膠柱將步驟三得到的濃縮液進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，上樣，用洗脫液洗脫，收集洗脫液，得到棘白菌素B的粗品。
[0036]步驟五、將步驟四得到的棘白菌素B的粗品重結(jié)晶、加熱回流和冷卻干燥后，得到棘白菌素B的純品。產(chǎn)品收率達(dá)到80 %以上，產(chǎn)品純度不低于98.0 %。
[0037]所述的棘白菌素B的提取純化方法中，所述步驟一中，棘白菌素B的發(fā)酵液用稀酸調(diào)節(jié)pH值為4.5?5.5，攪拌30?50min后，2000rpm以上離心20min得到無(wú)細(xì)胞的菌絲體，然后在菌絲體中加入3?7倍體積的乙醇，攪拌I?5小時(shí)，過(guò)濾后獲得菌絲體濾液。
[0038]所述的棘白菌素B的提取純化方法中，所述稀酸為稀鹽酸、稀硫酸、磷酸或醋酸中的任一種。
[0039]所述的棘白菌素B的提取純化方法中，所述稀酸為稀鹽酸。
[0040]所述的棘白菌素B的提取純化方法中，所述步驟三中，濃縮液中加入濃縮液I?4倍體積的乙醇，攪拌I?5小時(shí)，于-10?O °C下析出固體備用。
[0041]所述的棘白菌素B的提取純化方法中，所述步驟四中，將凝膠柱裝柱后，用體積比為1:1