一種磁性殼聚糖微球固定化黃嘌呤氧化酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及固定化酶領(lǐng)域，具體設(shè)及一種磁性殼聚糖微球固定化黃嚷嶺氧化酶的 制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 磁性材料是一種用途廣泛，歷史悠久的功能材料。早在3000年W前，古人便將天然 磁鐵作為指南針使用，在現(xiàn)代，磁性材料被用作永磁馬達(dá)、磁軟盤(pán)、變壓器中的鐵屯、材料，作 為存儲(chǔ)器使用的磁光盤(pán)，計(jì)算機(jī)用磁記錄軟盤(pán)等等。磁性殼聚糖微球作為高分子材料與磁 性材料的復(fù)合物，一方面有著優(yōu)良的超順磁性，使其很容易在外加磁場(chǎng)下實(shí)現(xiàn)對(duì)祀向物質(zhì) 的富集、分離和回收利用；另一方面，又可通過(guò)活化修飾引入如醒基、簇基、環(huán)氧基等的功能 性基團(tuán)而使其具有更多的功能特性。運(yùn)些性質(zhì)使磁性殼聚糖微球具有標(biāo)記、固定、引導(dǎo)和磁 分離的功能，從而在酶工程、細(xì)胞生物學(xué)、分離工程、分子生物學(xué)等領(lǐng)域有著良好的發(fā)展前 景。
[0003] 近年來(lái)，關(guān)于磁性殼聚糖微球制備及其應(yīng)用的研究越來(lái)越廣泛，尤其是在固定化 酶方面。例如研究發(fā)現(xiàn)利用磁性殼聚糖磁性微球，用于固定化血紅密孔菌漆酶 (Biochemical Engineering Journal,2005,25(1): 15-23)、月旨肪酉每（Biomass and Bioenergy ,2012,36:373-80)及纖維素酶(華南理工大學(xué)2012年碩±學(xué)位論文），可使酶的 熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性、儲(chǔ)存穩(wěn)定性W及酶的工作效率等得到很大程度的改善。
[0004] 黃嚷嶺氧化酶/脫氨酶廣泛存在于植物(小麥、魏豆苗、擬南芥等）、動(dòng)物(牛奶、小 鼠乳腺及肝臟等)及微生物(節(jié)桿菌、鏈霉菌、光合細(xì)菌等）中，是一種含鋼、無(wú)機(jī)硫化物、非 血紅素鐵的黃素酶，能夠催化次黃嚷嶺、黃嚷嶺生成尿酸，直接調(diào)控著體內(nèi)尿酸水平的高 低，是體內(nèi)嚷嶺代謝的關(guān)鍵酶。黃嚷嶺氧化酶作為一種重要的代謝調(diào)控酶，在醫(yī)學(xué)診斷及工 業(yè)應(yīng)用中具有遠(yuǎn)大前景，但游離酶較差的穩(wěn)定性直接影響其應(yīng)用。
[0005] 國(guó)內(nèi)外關(guān)于黃嚷嶺氧化酶穩(wěn)定性的研究主要集中于改變?nèi)芤涵h(huán)境提高其穩(wěn)定性， 對(duì)固定化方法的研究較少。張玉然等用修飾的瓊脂糖介質(zhì)及大孔陰離子交換樹(shù)脂固定化黃 嚷嶺氧化酶，發(fā)現(xiàn)W谷氨酸為連接臂的瓊脂糖介質(zhì)（Sepharose-Glu)固定化效果最佳，酶活 回收率達(dá)到15.5% (食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2014,33(1) :16-21)。陳國(guó)南等研究W黃嚷嶺氧 化酶修飾的電加熱碳糊電極，發(fā)現(xiàn)電極的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與次黃嚷嶺的濃度呈線性關(guān)系， 另外，不同于一般的溫敏電極，該電極的溫度是可控的（Analytical化emis化y ,2008,80 (8): 2826-2831) sRa化el Radi等將黃嚷嶺氧化酶固定在由裡皂石納米顆粒構(gòu)成的玻碳電 極上進(jìn)行電化學(xué)研究，所制備的固定化酶不僅保留其生物活性，而且顯示良好的電化學(xué)性 能（Biosensors and Bioelectronics,2009,24(12):3556-3561)。
[0006] 專利公開(kāi)號(hào)為CN1368552A的專利公開(kāi)了 "一種可見(jiàn)光交聯(lián)復(fù)合樹(shù)脂固定黃嚷嶺氧 化酶活性細(xì)胞的方法"，公開(kāi)日期為2002年9月11日，申請(qǐng)人為武漢大學(xué)。該方法W可見(jiàn)光交 聯(lián)復(fù)合樹(shù)脂作為載體，將黃嚷嶺氧化酶活性細(xì)胞包埋于其中，經(jīng)可見(jiàn)光照射，制備了固定化 細(xì)胞。制備的固定化細(xì)胞具有抗微生物分解性能好，機(jī)械強(qiáng)度高，化學(xué)性能穩(wěn)定，重復(fù)反應(yīng) 穩(wěn)定性高，酶活保留高等方面的優(yōu)點(diǎn)。
[0007] 專利公開(kāi)號(hào)為CN1834241A的專利公開(kāi)了 "一種固定化黃嚷嶺氧化酶及其制備方法 和用途"，公開(kāi)日期為2006年9月20日，申請(qǐng)人為武漢大學(xué)。方法如下:將碳納米管開(kāi)管氧化， 用水洗涂至中性并烘干，將烘干后的碳納米管和雙十六烷基憐酸加入蒸饋水中，超聲分散 得分散液;將分散液涂附在基體上，烘干，得到混合膜;將混合膜放入黃嚷嶺氧化酶溶液吸 附，得到固定化黃嚷嶺氧化酶。該專利的突出特點(diǎn)是能同時(shí)得到黃嚷嶺氧化酶Ξ對(duì)氧化還 原中屯、的電化學(xué)信號(hào)，并且黃嚷嶺氧化酶保持其生物活性，能催化其底物-硝酸根的還原， 有較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。
[0008] 專利公開(kāi)號(hào)為CN103558306A的專利公開(kāi)了 "一種篩選黃嚷嶺氧化酶抑制劑的復(fù)合 物及其應(yīng)用方法"，公開(kāi)日期為2014年2月5日，申請(qǐng)人為中南大學(xué)。該專利通過(guò)戊二醒作為 交聯(lián)劑，將黃嚷嶺氧化酶固定在氨基化的四氧化Ξ鐵納米粒子表面，得到黃嚷嶺氧化酶修 飾的磁性納米四氧化Ξ鐵粒子，用于快速篩選中草藥中抑制黃嚷嶺氧化酶的活性物質(zhì)。
[0009] 綜上所述，關(guān)于固定化方法的研究，大多數(shù)是將黃嚷嶺氧化酶固定成酶電極，用作 電化學(xué)研究。目前關(guān)于磁性殼聚糖微球固定化黃嚷嶺氧化酶的報(bào)道尚無(wú)，而本發(fā)明提供了 一種新的固定化黃嚷嶺氧化酶的方法，且該方法得到的固定化酶機(jī)械強(qiáng)度高，穩(wěn)定性好，生 物活性高，可用于后續(xù)的蛋白分離與純化研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是提供一種磁性殼聚糖微球固定化黃嚷嶺氧化酶的制備方法，該方 法得到的固定化酶不僅保留其高效的生物活性，還具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)利用性，而且 該方法本身具有操作簡(jiǎn)單，條件易于控制等優(yōu)點(diǎn)。
[0011] 本發(fā)明的目的通過(guò)W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0012] -種磁性殼聚糖微球固定化黃嚷嶺氧化酶的制備方法，該方法利用化學(xué)共沉淀法 審恪Fe3〇4磁性顆粒，并WFe3〇4磁性顆粒為磁核通過(guò)乳化交聯(lián)法制備磁性殼聚糖微球，用環(huán) 氧氯丙烷對(duì)磁性殼聚糖微球表面進(jìn)行活化，用于黃嚷嶺氧化酶的固定化研究。
[0013] 進(jìn)一步地，所述化學(xué)共沉淀法制備Fe3〇4磁性顆粒的步驟為:將摩爾比為3:1~1:1 的FeCl3 ·細(xì)2〇和FeCl2 · 4此0混合，氮?dú)獗Ｗo(hù)下滴加化0H溶液，至溶液變?yōu)楹诹辽?0~50 °C下攬拌30~40min，結(jié)束后加入0.5~1血油酸，于70~80°C水浴振蕩下熟化30~60min，超 聲10~20min;冷卻后用磁鐵吸附，用無(wú)水乙醇和去離子水洗涂，干燥，得化3化磁性顆粒。
[0014] 更進(jìn)一步地，所述化學(xué)共沉淀法制備化3〇4磁性顆粒的步驟為:將摩爾比為3:1~1: 1的FeCl3 · 6出0和化Cl2 · 4出0混合，氮?dú)獗Ｗo(hù)下滴加化0田容液，至溶液變?yōu)楹诹辽?0°C下 攬拌30min，結(jié)束后加入0.5mL油酸，于80°C水浴振蕩下熟化30min，超聲lOmin;冷卻后用磁 鐵吸附，用無(wú)水乙醇和去離子水洗涂，干燥，得化3化磁性顆粒。
[001引更進(jìn)一步地，所述FeCb · 6出0和FeCl2 · 4出0的摩爾比為4:3~2:1。
[0016]進(jìn)一步地，所述乳化交聯(lián)法制備磁性殼聚糖微球的步驟為：制備10~15mg/mL的殼 聚糖醋酸溶液，在溶液中加入Fe3〇4磁性顆粒，超聲分散30~40min;分散結(jié)束后，加入80~ 120mL液體石蠟、1.5~3mL吐溫-80、1.5~3g Span-80，在40~60°C水浴條件下攬拌30~ 40min;逐滴加入1~5ml戊二醒溶液，升溫至60~70°C，攬拌1~1.化，逐滴滴加化0田容液調(diào) 節(jié)pH至9.0~11.0,置于70-75°C恒溫振蕩1~1.5h，超聲10~15min;冷卻后用磁鐵吸附分 離，用無(wú)水乙醇和去離子水洗涂，干燥，得磁性殼聚糖微球。
[0017]更進(jìn)一步地，所述乳化交聯(lián)法制備磁性殼聚糖微球的步驟為：制備10~15mg/血的 殼聚糖醋酸溶液，在溶液中加入Fe3〇4磁性顆粒，超聲分散30min ;分散結(jié)束后，加入80~ 1201^液體石蠟、1.5~31^吐溫-80、1.5~3旨59311-80，在40°(3水浴條件下攬拌30111111;逐滴 加入2ml戊二醒溶液，升溫至60°C，攬拌化，逐滴滴加化OH溶液調(diào)節(jié)抑至9.0~11.0左右，置 于70°C恒溫振蕩化，超聲10~15min;冷卻后用磁鐵吸附分離，用無(wú)水乙醇和去離子水洗涂， 干燥，得磁性殼聚糖微球。
[0018] 更進(jìn)一步地，殼聚糖與Fe3〇4磁性顆粒的質(zhì)量比為2:1~1:2,水相與油相的體積比 為1:3~1:6,戊二醒的體積分?jǐn)?shù)為10~50%。
[0019] 進(jìn)一步地，所述對(duì)磁性殼聚糖微球表面進(jìn)行活化的步驟為:稱取磁性殼聚糖微球 于離屯、管內(nèi)，加入化0田容液與環(huán)氧氯丙烷溶液，攬拌混勻，加入NaBH4溶液，恒溫水浴振蕩反 應(yīng)3~化。
[0020] 更進(jìn)一步地，恒溫水浴振蕩反應(yīng)地。
[0021] 進(jìn)一步地，所述化0田容液的濃度為0.2~1.6mol/L，環(huán)氧氯丙烷溶液的體積分?jǐn)?shù)為 10~50 %，NaBH4溶液的濃度為0.3~1.5g/L。
[0022] 進(jìn)一步地，對(duì)所制備的Fe3〇4磁性顆粒和磁性殼聚糖微球進(jìn)行了紅外、粒徑及熱重 分析，證明化3化磁性顆粒成功包裹在殼聚糖中。
[0023] 進(jìn)一步地，所述黃嚷嶺氧化酶的固定化步驟為:稱取0.01~0.05g經(jīng)過(guò)活化的磁性 殼聚糖微球于離屯、管中，加入100~50化L黃嚷嶺氧化酶酶液，2~4mL化is-HCl緩沖液，在 水浴震蕩下進(jìn)行固定化，得磁性殼聚糖微球固定化黃嚷嶺氧化酶。
[0024] 進(jìn)一步地，所述固定化時(shí)間為30~ISOmin，固定化溫度為25~60°C，固定化pH為 6.0 ~10.0。
[0025] 黃嚷嶺氧化酶酶活測(cè)定方法:稱取0.01~0.05g的磁性殼聚糖微球固定化黃嚷嶺 氧化酶于離屯、管中，加入40化L 1~lOmmol/L的黃嚷嶺標(biāo)準(zhǔn)液，3mL顯色液，水浴保溫20min 后磁鐵分離，取清液在508nm下測(cè)定吸光值。W顯色液作為參比溶液。
[0026] 固定化黃嚷嶺氧化酶活力單位(U/g)定義:在30°C下每克磁性殼聚糖微球固定化 黃嚷嶺氧化酶每分鐘催化ΙμL?ο?黃嚷嶺，出0和化生成Ιμπιο?出化和尿酸為1個(gè)活力單位。
[0027]
[002引式中：C為此化濃度，mmo 1/1; V為溶液總體積，mM t為反應(yīng)時(shí)間，min ;m為微球質(zhì)量，邑。
[0029]
[0030] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)與技術(shù)效果：
[0031 ] (1)制備步驟簡(jiǎn)單易行，利于工業(yè)生產(chǎn)；
[0032] (2)載體具有較好的機(jī)械強(qiáng)度，不會(huì)因機(jī)械攬拌或其他作用力影響破碎或脫落，載 體可有效回收利用；
[0033] (3)本發(fā)明制備的固定化酶保持其生物活性，有較好的重現(xiàn)性；
[0034] (4)本發(fā)明制備的固定化酶具有良好的熱穩(wěn)定性，pH穩(wěn)定性及操作穩(wěn)定性。
【附圖說(shuō)明】
[0035] 圖1為實(shí)施例lFe3化磁性顆粒、殼聚糖、未活化和已活化磁性殼聚糖微球的傅里葉 變換紅外光譜圖。
[0036] 圖2為實(shí)施例lFe3化磁性顆粒、未活化和已活化磁性殼聚糖微球的粒徑分布圖。
[0037] 圖3為實(shí)施例1磁性殼聚糖微球的熱重分析(DTG)和差示掃描量熱分析(DSC)圖。
[0038] 圖4為實(shí)施例1固定化酶的最適溫度曲線圖。
[0039] 圖5為實(shí)施例1固定化酶的最適pH曲線圖。
[0040] 圖6為實(shí)施例1固定化酶的熱穩(wěn)定性曲線圖。
[0041] 圖7為實(shí)施例1固定化酶的pH穩(wěn)定性曲線圖。
[0042] 圖8為實(shí)施例1固定化酶的操作穩(wěn)定性圖。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)