涉及核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物的組合物和方法
【專利說明】潰及核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物的組合物和方法
[0001] 相關(guān)申請
[0002] 本申請要求2013年7月10日提交的標(biāo)題為乂OMPOSmONS AND MET冊DS RELATING TO NUCLEIC ACID-PROTEIN COMPLEXES"的美國臨時申請?zhí)?1/844,818的權(quán)益，其完整內(nèi)容 通過引用并入本文。
[0003] 聯(lián)邦政府資助的研究
[0004] 本發(fā)明是在美國國立衛(wèi)生研究院授予的DC002281下由美國政府資助進行的。美國 政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] DNA已成為所選擇的用于構(gòu)建自組裝納米結(jié)構(gòu)的支架。隨著用于運些結(jié)構(gòu)的程序 圖形化的技術(shù)已取得進展，現(xiàn)在可能產(chǎn)生復(fù)雜的組裝體（Linko and Dietz, Curr. Opin. Biotechnol. 24: 555-561，2013)。為了利用運些結(jié)構(gòu)元件并將它們制成功能性 納米機器，常常需要在非常特異的位點上滲入蛋白質(zhì)(Niemeyer,化ends in Biotech 20: 395-401,2002)。遇到的阻礙是將目標(biāo)蛋白質(zhì)偶聯(lián)于DNA的成功方法。常規(guī)用于將蛋白質(zhì)連 接于寡核巧酸（寡聚物）的化學(xué)過程包括二硫鍵聯(lián)和硫醇-伯胺鍵聯(lián)（Cecconi C.等， Eur.Bio地ys.J.37(6):729-38,2008);Halvorsen等，化notechnol.22:494005-494012, 2011;Niem巧er and Sacca，化em. Soc. Rev. 40: 5910-5921，2011)。雖然運些化學(xué)過程有時 是有效的，但它們與生物學(xué)中常見的官能團反應(yīng)。因此當(dāng)目標(biāo)蛋白質(zhì)具有內(nèi)源半脫氨酸時 或當(dāng)想要附接于特定的伯胺（除了N末端W外，每個賴氨酸提供伯胺）時，不能使用運些技 術(shù)。為了克服許多的運些問題，研究小組已著手開發(fā)生物正交技術(shù)諸如無銅點擊化學(xué) (Gordon等，J. Am. Chem. Soc. 134:9199-9208，2012)。雖然運些技術(shù)克服了特異性和化學(xué)計 量的問題，但它們遭受面向所有巧巾技術(shù)的問題。所有運些技術(shù)需要在亞最佳的生理條件下 進行反應(yīng)。由于長期處于室溫、氧化/還原條件或高/低pH條件下，當(dāng)利用許多在運些條件下 不是非常熱穩(wěn)定的并且具有聚集和/或從溶液沉淀出來的傾向的蛋白質(zhì)進行作用時運些化 學(xué)過程開始失效。除了關(guān)于運些化學(xué)過程的障礙W外，必需針對不同的蛋白質(zhì)謹(jǐn)慎地改變 條件，并且不存在選擇性純化出所需產(chǎn)物的方法。
[0007] 發(fā)明概述
[000引本公開內(nèi)容部分地提供用于將核酸綴合于蛋白質(zhì)的新型和穩(wěn)健的方法，所述方法 克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺點。運些方法前置待對核酸(包括寡核巧酸)和小(通常合成的）膚進行 的化學(xué)過程。運樣的核酸和膚對于可用于進行本公開內(nèi)容中設(shè)及的某些化學(xué)過程的非生理 條件通常是更加耐受的。
[0009] 本公開內(nèi)容提供了兩步法及其變型，其包括首先將核酸(例如，DNA)綴合于短的通 常合成的膚，W形成核酸-膚綴合物，隨后使用轉(zhuǎn)膚酶(例如，分選酶)反應(yīng)將核酸-膚綴合物 綴合于目標(biāo)蛋白質(zhì)。兩步法的至少一個有利方面是將蛋白質(zhì)與不利的反應(yīng)環(huán)境分離的能 力，所述不利的反應(yīng)環(huán)境可能降低所述蛋白質(zhì)的活性。通過該兩步法，在第一步驟中使用運 些不利的反應(yīng)條件，并在第二步驟中引入所述蛋白質(zhì)。
[0010] 因此，在一些情況下，本公開內(nèi)容的方法包括將核酸(諸如寡核巧酸)綴合于包含 一個或多個連續(xù)的N-末端甘氨酸(G)殘基的氨基酸序列。在一些實施方案中，氨基酸序列包 含3個連續(xù)的N末端甘氨酸殘基。氨基酸序列通常被包含在短膚(通常為合成膚）中。N-末端 GGG基序由本公開內(nèi)容的方法中使用的分選酶識別。
[0011] 氨基酸序列還可包含可用于純化目的的額外氨基酸序列。運些氨基酸序列在本文 中可被稱為純化標(biāo)簽或親和標(biāo)記，并且包括但不限于化S-標(biāo)簽和Flag序列（或Flag標(biāo)簽）， 其氨基酸序列在本領(lǐng)域中是已知的并且提供于本文中。
[0012] 寡核巧酸至膚的綴合可使用例如生物正交銅催化點擊化學(xué)反應(yīng)來實現(xiàn)。待綴合于 膚的寡核巧酸可包含疊氮化物。疊氮化物可位于3'末端或5'末端，或者它可W是內(nèi)部的疊 氮化物。待被綴合的膚可包含烘控，其用作互補點擊試劑。或者，所述膚可包含疊氮化物并 且所述寡核巧酸可包含烘控。應(yīng)當(dāng)理解，可使用其它綴合方法來實現(xiàn)核酸至膚的綴合。例 如，該第一步驟還可使用橫基班巧酷亞胺-4-(N-馬來酷亞胺甲基)環(huán)己燒-1-簇酸醋(SMCC) 將脫氨酸(膚中的)偶聯(lián)于胺官能化的寡核巧酸來實現(xiàn)。
[0013] 該第一反應(yīng)步驟的所得產(chǎn)物是綴合于包含一個或多個(例如3個)甘氨酸殘基和任 選地純化標(biāo)簽諸如(但不限于)Flag氨基酸序列的氨基酸序列（即，膚)的核酸(例如，寡核巧 酸）。偶聯(lián)于膚的核酸可W被移除(例如，與其它反應(yīng)物分離)和任選地通過利用純化標(biāo)簽從 反應(yīng)混合物中純化。一種方法是使用珠粒諸如磁珠，或基于柱的珠漿體，其中的任一種包含 結(jié)合純化標(biāo)簽的針對純化標(biāo)簽的結(jié)合伴侶(例如，所述結(jié)合伴侶可W是特異于所述純化標(biāo) 簽的抗體）。
[0014] 氨基酸序列還可含有額外的可切割序列。運樣的序列可在酶存在的情況下或通過 另一種機制被切割。運樣，將綴合的核酸與其它反應(yīng)物分離后，可從綴合的核酸除去純化標(biāo) 簽，只留下隨后可接近第二步驟中所使用的分選酶的一個或多個(例如3個)末端甘氨酸殘 基。在一些實施方案中，酶可切割的氨基酸序列可由煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶切割?？捎?TEV蛋白酶切割的氨基酸序列的實例是包含E化YFQ(SEQ ID N0:1)的氨基酸序列?；蛘?，可 切割的序列可通過非酶促方法(例如，光)切割?？汕懈畹男蛄型ǔＮ挥诩兓瘶?biāo)簽與一個或 多個(例如3個)甘氨酸殘基之間。
[0015] 在方法的第二步驟中，所得的綴合于一個或多個(例如，3個)末端甘氨酸殘基的核 酸隨后與目標(biāo)蛋白質(zhì)反應(yīng)。目標(biāo)蛋白質(zhì)可天然地含有還是分選酶或另一種轉(zhuǎn)膚酶的祀序列 的氨基酸序列，或者可選擇地所述蛋白質(zhì)可被工程化W含有運樣的氨基酸序列。運些氨基 酸序列在本文中可被稱為分選酶(或轉(zhuǎn)膚酶)祀序列。
[0016] 分選酶祀序列的一個實例為LPXTGX'n(SEQ ID N0:2)，其中X和X'是獨立選擇的氨 基酸，并且η為大于0的任何數(shù)值或任何數(shù)值的范圍，包括例如1-90、1-99或I-IOOdX'。從而 意欲表示所述氨基酸序列可在一個末端含有任意數(shù)目的氨基酸殘基（即，η個數(shù)目的X'氨基 酸殘基，其中每個X'氨基酸殘基獨立地選自每個其它X'氨基酸殘基，其中η可W為1-100,或 1-99或1-90,或其間的任何數(shù)值）。一個運樣的序列為LPETGX'n(SEQ ID ^:3)，其中乂'為氨 基酸并且η為大于0的任何數(shù)值或任何數(shù)值的范圍，包括例如1-90、1-99或1-100。術(shù)語"氨基 酸"和"氨基酸殘基"在本文中可互換使用。還應(yīng)理解，X和X'可W是本文中所述的任何實施 方案中的任何氨基酸。如本文中所述，分選酶祀序列還可包含純化標(biāo)簽。
[0017] 目標(biāo)蛋白質(zhì)與寡核巧酸-膚綴合物之間的反應(yīng)在分選酶或另一種轉(zhuǎn)膚酶存在的情 況下發(fā)生。在一些實施方案中，所述分選酶為分選酶Α。在一些實施方案中，所述分選酶為分 選酶A的進化變體，諸如由化en等，PNAS 108:11399-11404，2011所描述的。術(shù)語"分選酶"和 "分選酶類"在本文中可互換使用。分選酶執(zhí)行綴合于核酸(通過綴合的膚)的甘氨酸殘基與 存在于目標(biāo)蛋白質(zhì)中或綴合于目標(biāo)蛋白質(zhì)的分選酶祀序列中的甘氨酸殘基的換位。
[0018] 該第二反應(yīng)的產(chǎn)物是通過氨基酸接頭綴合于目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸。所述氨基酸接頭 可具有LPXTGn(SEQ ID ^):17)的序列，其中11表示6殘基的數(shù)目并且是大于0的任何數(shù)值或 任何數(shù)值的范圍。在一些實施方案中，所述氨基酸接頭可具有LPXTGGG(SEQ ID N0:9)的序 列。在一些實施方案中，所述氨基酸接頭可具有LPETGn(SEQ ID N0:4)的序列，其中η表示G 殘基的數(shù)目并且是大于0的任何數(shù)值或任何數(shù)值的范圍。在一些實施方案中，所述接頭具有 口^了666(569 10^:5)的序列。
[0019] 隨后可使用例如珠?；蚱渌谟H和力的方法純化該最終的綴合產(chǎn)物。運樣的純 化可使得將核酸-蛋白質(zhì)綴合物與其它反應(yīng)組分諸如分選酶、TEV酶和/或在分選酶介導(dǎo)的 換位后從蛋白質(zhì)釋放的任何氨基酸序列分離。此情形通過在分選酶介導(dǎo)的作用后純化標(biāo)簽 的差異使用或存在來實現(xiàn)。例如，可將反應(yīng)組分諸如分選酶、TEV酶和/或在分選酶介導(dǎo)的換 位后從目標(biāo)蛋白質(zhì)釋放的氨基酸序列綴合于純化標(biāo)簽，并且該標(biāo)簽可用于從最終的目標(biāo)綴 合產(chǎn)物除去運些組分。在優(yōu)選實施方案中，將待例如從終產(chǎn)物除去的所有組分綴合于相同 的純化標(biāo)簽。適合的純化標(biāo)簽包括化S-標(biāo)簽（例如，6His殘基，（SEQ ID N0:6))或包含 DYKDD孤K(SEQ ID NO: 7)或由其組成的Flag氨基酸序列。運樣的純化步驟可用于使目標(biāo)核 酸-蛋白質(zhì)綴合物/復(fù)合物不含任何副產(chǎn)物和反應(yīng)物。
[0020] 因此，在一個方面，本公開內(nèi)容提供了方法，所述方法包括在分選酶存在的情況 下，將（1)綴合于包含一個或多個N末端甘氨酸(G)殘基的氨基酸序列的核酸(例如，DNA)與 (2)包含LPXTGX'n(其中X和X'是任意獨立選擇的氨基酸并且η為范圍1-99內(nèi)的任何數(shù)值） (SEQ ID Ν0:8)的C末端氨基酸序列的蛋白質(zhì)反應(yīng)，W形成包含通過具有LPXTGGG(SEQ ID N0:9)的氨基酸序列的氨基酸接頭共價綴合于蛋白質(zhì)的核酸的復(fù)合物，其中X為任意氨基 酸。接頭和核酸可存在于綴合后的目標(biāo)蛋白質(zhì)的C末端上或其附近。
[0021] 在另一個方面，本公開內(nèi)容提供了方法，所述方法包括在分選酶存在的情況下，將 (1)綴合于包含末端甘氨酸（G)殘基的氨基酸序列的核酸（例如，DNA)與（或用）（2)包含 1口6了6乂。(其中乂是氨基酸并且11為大于0的數(shù)值或大于0的數(shù)值的范圍）（56〇10^:10)的末 端氨基酸序列的蛋白質(zhì)反應(yīng)，^形成包含通過具有1^^了666(56〇10^:5)的氨基酸序列的 氨基酸接頭共價綴合于蛋白質(zhì)的核酸的復(fù)合物。在一些實施方案中，V'在長度上可W是1- 99個氨基酸。在一些實施方案中，V'為大于1的數(shù)值。
[0022] 在一些實施方案中，分選酶和包含LPETGXn(SEQ ID ^:10)的末端例如(：末端氨基 酸序列的蛋白質(zhì)各自包含化S-標(biāo)簽。在目標(biāo)蛋白質(zhì)的情況下，可將化S標(biāo)簽提供在分選酶祀 序列的Xn(或X'n)氨基酸序列中或作為其部分。
[0023] 在一些實施方案中，通過核酸與包含一個或多個優(yōu)選3個G殘基的膚之間的生物正 交銅催化的點擊化學(xué)反應(yīng)形成綴合于包含末端甘氨酸(G)殘基的氨基酸序列的核酸。在一 些實施方案中，所述生物正交銅催化的點擊化學(xué)反應(yīng)形成綴合物(其在本文中可被稱為核 酸中間產(chǎn)物），其包含綴合于包含一個或多個甘氨酸(G)殘基和任選純化標(biāo)簽(諸如但不限 于Flag序列）W及還任選地可切割的氨基酸序列（諸如但不限于TEV祀(切割）序列，優(yōu)選地 位于G殘基與純化標(biāo)簽之間）的氨基酸序列的核酸。
[0024] 所述方法從而還可包括從核酸中間產(chǎn)物切割純化標(biāo)簽，W使得甘氨酸殘基可接近 分選酶。例如，在一些實施方案中，所述方法還包括將核酸中間產(chǎn)物與TEV蛋白酶反應(yīng)。在一 些實施方案中，將TEV蛋白酶綴合于化S-標(biāo)簽。His-標(biāo)簽可W是包含6個組氨酸殘基或由其 組成的氨基酸序列（SEQ ID N0:6)。
[0025] 在另一個方面，本發(fā)明提供了包含通過具有LPETGGG(氨基至簇基）或GGGTEPL(簇 基至氨基KSEQ ID N0:5)的氨基酸序列的氨基酸接頭共價綴合于蛋白質(zhì)的核酸的復(fù)合物。 在附圖中舉例說明了該接頭在核酸與目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的放置。
[0026] 在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)是天然存在的蛋白質(zhì)并且所述分選酶祀序列或接 頭序列諸如如上定義的^^了6乂'。(569 10顯:2)或1?6了666(569 10^:5)不存在于天然存 在的蛋白質(zhì)中。
[0027] 在一些實施方案中，所述核酸的長度為1-100個核巧酸。在一些實施方案中，所述 核酸在綴合至膚之前包含DNA或由其組成。
[0028] 在另一個方面，本發(fā)明提供了包含分離形式的任何前述復(fù)合物或綴合物的組合 物，無論運樣的復(fù)合物或綴合物是中間產(chǎn)物還是終產(chǎn)物。因此，本公開內(nèi)容提供了各自包含 綴合于膚的核酸的一種或多種綴合物，其中所述膚包含一個或多個(例如，3個)甘氨酸。運 些綴合物可在它們的核酸序列上彼此相異，但可具有相同的氨基酸序列。本公開內(nèi)容類似 地提供了各自包含分選酶祀序列諸如上文中定義的LPXTGX'n(SEQ ID N0:2)的一種或多種 不同的蛋白質(zhì)。本公開內(nèi)容類似地提供了用于制備核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物或綴合物的多種前 述核酸-膚綴合物和蛋白質(zhì)。本公開內(nèi)容還提供了各自包含通過具有LPXTGGG(SEQ ID NO: 9)的氨基酸序列的氨基酸接頭綴合于蛋白質(zhì)的核酸的一種或多種綴合物。運些綴合物可在 它們的核酸序列和/或它們的氨基酸序列上彼此不同。因此，它們可具有相同的核酸序列， 或它們可具有相同的氨基酸序列，或它們可具有不同的核酸和氨基酸序列。因此，本公開內(nèi) 容提供了各自呈分離形式的多個任何前述復(fù)合物或該群體為分離形式(任選地文庫形式）。
[0029] 在另一個方面，本發(fā)明提供了包含W下的兩種或更多種的任意組合的組合物:綴 合于包含末端甘氨酸(G)殘基(包括3個G殘基）的氨基酸序列的核酸、包含LPXTGX'n(其中X 和