一種多聚體酶-抗體及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學檢測技術領域，特別是涉及一種多聚體酶-抗體及其制備方法。
【背景技術】
[0002]免疫組織化學是一種利用抗原與抗體特異性識別的特征進行對病理標本中腫瘤特異性蛋白或抗原檢測的免疫組織化學技術[1、2]。這個技術不僅能夠檢測到特征物質的性質和量，更因為這種技術能夠特征蛋白或抗原原本的位置上并在保持組織原有形態(tài)的基礎上進行檢測，使之成為對病理病因分析(尤其是對腫瘤病理的分析)最為有效的方法，已成為腫瘤診斷、鑒定、鑒別和療效預測等最為普遍使用的臨床方法之一。
[0003]免疫組織化學的實驗操作步驟和原理是[2、3]:1)通過外科手術獲取病理標本(月中瘤組織或其它病灶組織)，經(jīng)過?，斄展潭?，酒精脫水，石蠟包埋后，切片成3-5微米厚度的組織切片，粘附在玻片上。2)經(jīng)過有機溶劑脫蠟，酒精清洗和水化后，再經(jīng)過高溫烹煮使組織上的特征物質(比如腫瘤特征蛋白或抗原，或病原體蛋白)回復原有形狀。3)經(jīng)過使用特異性抗體(具有與特征物質或與特異性抗原結合能力的抗體，稱之為“一抗”)對特征蛋白的識別。4)經(jīng)過使用標記酶標記的抗一抗的抗體(稱之為“二抗”)的孵育，使酶標記的二抗與一抗結合，確定特異性特征物質(蛋白)的位置。5)使用顯色劑在標記酶的催化下起化學反應，形成不溶性有色化合物在原位上沉淀下來，從而顯示酶標二抗所存在的位置(也就是特征蛋白或抗原所在的位置。6)使用蘇木素把整個組織形態(tài)襯染出來以便于對組織形態(tài)的識另0。7)經(jīng)過這樣一個系列的操作過程，使腫瘤特征蛋白或病原體蛋白所存在的位置和量通過顏色的位置和深淺顯示出來，起到鑒定和鑒別的作用，指導臨床治療。
[0004]免疫組織化學整個試驗操作過程需要近三十個步驟[3、4]，包括:脫蠟、水化、內源性酶阻斷、清洗、高溫熱修復、冷卻、清洗、一抗孵育、清洗、二抗孵育、清洗、增效劑孵育、清洗、顯色、清洗、襯染、清洗、脫水、封片等步驟。這些步驟中除了需要規(guī)范的組織取樣和預處理外，影響切片標本處理效果的關鍵因素一是一抗的特異性和親和力，二是二抗的信號放大效果。而二抗的放大能力取決于二抗的特異性和親和力以及二抗上所標聯(lián)的標記酶的數(shù)量?，F(xiàn)有技術的原理及其缺點:目前市場常用的標記酶標聯(lián)的二抗其工作原理有以下三種方法:a)使用生物素-親生物素放大法[I](圖1)。此方法的原理是:在二抗上使用生物素標記，然后把標記酶與親生物素標聯(lián)[2]。在切片標本的處理過程中，在標本上滴加一抗之后，滴加生物素標記的二抗，接著再滴加與標記酶標聯(lián)的親生物素。利用親生物素與生物素之間的特異高親和力，使與親生物素標聯(lián)的標記酶定位在特征物質所在的位置上。此方法的優(yōu)點在于生物素是個有機小分子，因為體積小可以在二抗上較多地標記而較少影響二抗的特異性和親和力。在二抗上標記的生物素量多，就有可能與更多的標記酶標聯(lián)的親生物素結合，可以提高信號放大的效果，提高檢測靈敏度。然而，此方法存在一個嚴重的缺點是:生物素是生物體內存在的維生素之一，尤其在小腸組織，腎組織，腦組織和肝組織中普遍存在，使用生物素一親生物素放大法在上述組織中會出現(xiàn)與檢測本身無關的陽性信號，即出現(xiàn)假陽性的誤診可能。此方法的另一個缺點是需要多出一個操作步驟。b)直接酶-二抗標聯(lián)法[2](圖2)。此方法便是把標記酶通過有機小分子偶聯(lián)試劑直接標聯(lián)在二抗上。由于標記酶本身分子量較大(常用的過氧化酶分子量為40，OOODa，堿性磷酸酶分子量為140，OOODa，尿素酶分子量為200，000Da)，體積較大，只能在二抗分子上標聯(lián)1-2個酶分子，標聯(lián)多了便會降低二抗本身的特異性(降低特異性便會引起高背景和非特異性信號)以及降低二抗的親和力，降低了其檢測的靈敏度。c)多聚體酶-二抗標聯(lián)法。這是近一些年來新型的標記酶與二抗的標聯(lián)方法(圖3) [5，6]。為了減少標記酶對二抗特異性和親和力的損害，不直接將標記酶標聯(lián)到二抗分子上，而是將標記酶首先鏈接到一個鏈狀的有機高分子上(比如葡聚糖[5]，多聚賴氨酸多肽[6]等)，然后將此多聚了的多聚體酶標聯(lián)到二抗分子上面，既增加了每個二抗分子上標記酶的數(shù)目，又使標記酶與二抗有一定的空間距離，減少對二抗特異性和親和力的不利影響。與前面兩種標聯(lián)方法相比，多聚體酶標聯(lián)法排除了內源性生物素干擾的可能性，簡化了操作步驟(減少了一個步驟，改兩步:滴加生物素標記的二抗以及滴加酶標記的生物素成為一步:滴加多聚體酶標聯(lián)的二抗)同時具有較高的檢測靈敏度[5，
6]。此方法已成為市場上最為通用的切片標本處理的信號放大方法。但是此方法所存在的缺點是:鏈式多聚體酶標聯(lián)的二抗整體結構松散，體積較長，影響了對組織的穿透性，對一些存在于細胞核內特征物質的檢測需要比較長的孵育時間以達到所需要的靈敏度，對于一些在?，斄罩泄潭?浸泡)時間較長的組織的信號放大效果不夠有效。

【發(fā)明內容】

[0005]基于上述原因，申請人研究一種新的標記酶標聯(lián)抗體以及制備方法，本發(fā)明的多聚體酶-抗體:采用DVS活化標記酶(比如過氧化氫酶)，接著用活化了的過氧化氫酶與PAMAMDendrimer進行化學反應，形成多標記酶一PAMAM Dendrimer的多聚體酶。將此多聚體酶再次使用DVS活化，然后與二抗抗體混合孵育，得到多聚體酶標記的二抗抗體。
[000?] PAMAM Dendrimer是個球狀的多分枝有機分子，并在每個分支的末端各有可以活化的氨基。使用PAMAM Dendrimer為支架進行多聚生產(chǎn)的多聚體標記酶具有球狀體的緊密的分子結構。該方法克服目前使用鏈狀高分子多聚體酶標記方法的主要缺陷，極大地縮小了多聚體酶的體積，提高酶標的密度，使單位體積內標聯(lián)到二抗上的酶的數(shù)目大幅度增加。
[0007]本發(fā)明通過下述技術方案實現(xiàn)的。
[0008]—種多聚體酶-抗體的標聯(lián)方法，采用DVS活化的酶與PAMAM Dendrimer系列有機小分子聚合后獲得多聚體酶，多聚體酶用DVS進一步活化后，與抗體混合孵育，得到多聚體酶標聯(lián)的二抗抗體。
[0009]所述一種多聚體酶二抗抗體的標聯(lián)方法:
[0010]I)將標記酶(比如過氧化氫酶)在室溫下溶解在0.1Μ、ρΗ8.0碳酸氫鈉溶液，加入DVS，在20-35 °C下溫和攪拌20-40鐘；
[0011]2)將上述反應液經(jīng)Sephadex G_25的柱子純化去除剩余的DVS，洗脫溶劑為0.1M、PH8.0的碳酸氫鈉溶液，收集含酶的組分，濃縮至小于原有體積的兩倍，得到活化酶溶液；
[0012]3)取活化酶溶液，加入PAMAM 5.0，活化酶溶液與PANMAM的分子數(shù)比例為30_50:1，將此溶液在20-35°C下溫和攪拌16個小時；
[0013]4)將第3)步溶液經(jīng)過Sephadex G-25的柱子純化，洗脫溶劑為0.1Μ、ρΗ8.0的碳酸氫鈉溶液，第一個棕色的組分為多聚體過氧化酶溶液，將收集到的溶液濃縮至約等于原有的體積；
[0014]5)向第4)步的溶液中加入DVS，DVS與酶的分子比例為10_30:1，在20-35 °C下攪拌2-4個小時；G-25分離柱子將剩余的DVS去除，洗脫溶液為I3BSd3BS為1mM磷酸鈉、140mM氯化鈉，pH=7.40)，收集棕色組分，棕色的組分為活化了的多聚體過氧化酶，濃縮至等于原有的體積；
[0015]6)取二抗抗體和第5)步活化的多聚體過氧化酶溶液混合，混合均勻，在黑暗中在室溫下靜止孵育12-48小時;加入牛血清蛋白以及0.1%的Proclin-300，得到得到多聚體酶標-抗體。
[0016]上述所述的酶包括:過氧化酶、堿性磷酸酶或尿素酶。
[0017]上述所述的抗體包括:鼠抗羊免疫球蛋白、兔抗羊免疫球蛋白、羊抗鼠免疫球蛋白、羊抗兔免疫球蛋白、馬抗羊免疫球蛋白、馬抗鼠免疫球蛋白、馬抗兔免疫球蛋白、鼠抗人免疫球蛋白、兔抗人免疫球蛋白、羊抗人免疫球蛋白、馬抗人免疫球蛋白等，以及以上各種抗體的活性片段，比如Fab或(Fab)2片段等。
[0018]所述的多聚體酶-抗體在免疫組織化學中的應用。
[0019]所述的多聚體酶-抗體在腫瘤檢測中的應用。
[0020]本發(fā)明具有有益的技術效果:
[0021]I)本發(fā)明增加了二抗上標聯(lián)酶的數(shù)量和密度從而提高了檢測靈敏度(圖5、6)。尤其是對存在于細胞核內抗原的檢測的靈敏度明顯提高(圖7、8)，因為體積小的酶標聯(lián)的二抗更容易滲透到細胞核內與核抗原結合。
[0022]2)采用球狀多分支有機小分子為載體，使多個酶緊密地連接到球狀多分支載體體分子上，增加了酶分子之間的緊密度，使標記酶更加穩(wěn)定。這是酶和其它蛋白質共有的特征，當他們的濃度越高或者越相互靠近，穩(wěn)定性越好(圖9-10)。
[0023]盡管以下本發(fā)明的實施方案進行了描述，但本發(fā)明并不局限于上述的具體實施方案和應用領域，下述的具體實施方案僅僅是示意性的、指導性的，而不是限制性的。本領域的普通技術人員在本說明書的啟示下和在不脫離本發(fā)明權利要求所保護的范圍的情況下，還可以做出很多種的形式，這些均屬于本發(fā)明保護之列。
【附圖說明】
[0024]圖1生物素-親生物素酶標二抗免疫組化法工作示意圖:1:組織抗原，2:一抗，3: 二抗，4:生物素，5:酶(過氧化酶、堿性磷酸酶或尿素酶)，6:親生物素。
[0025