一種高產(chǎn)低分子量熱凝膠的發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)低分子量熱凝膠的發(fā)酵方法，具體涉及到土壤桿菌和產(chǎn)熱凝膠內(nèi)切酶的霉菌耦合發(fā)酵高產(chǎn)低分子量熱凝膠的方法，屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]熱凝膠是一種由葡萄糖殘基通過(guò)β-D-l，3_葡萄糖苷鍵連接形成的水不溶性、無(wú)分支微生物胞外β-1，3_葡聚糖。土壤桿菌、根瘤菌和纖維菌素等多個(gè)屬的細(xì)菌已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)具有合成熱凝膠的能力，其中土壤桿菌ATCC 31749研究較多，可在氮源匱乏的條件下合成熱凝膠。
[0003]熱凝膠在生命科學(xué)、食品及醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。但是熱凝膠的水不溶性限制了其應(yīng)用前景。隨著分子量的降低，熱凝膠的水溶性和生物活性均會(huì)逐漸增大。目前關(guān)于土壤桿菌ATCC 31749發(fā)酵法生產(chǎn)熱凝膠的研究，主要集中在如何提高熱凝膠產(chǎn)量方面，且未見關(guān)于以熱凝膠的分子量為優(yōu)化指標(biāo)，對(duì)發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化的報(bào)道。
[0004]目前關(guān)于優(yōu)化土壤桿菌ATCC31749發(fā)酵法生產(chǎn)熱凝膠的過(guò)程，主要包括對(duì)碳源、氮源、ΡΗ、溶氧及磷酸鹽等方面，但是所有的報(bào)道中未能徹底解決熱凝膠對(duì)土壤桿菌ATCC31749的包裹導(dǎo)致產(chǎn)量較低的問題。
[0005]目前降低熱凝膠分子量過(guò)程和生產(chǎn)熱凝膠是兩個(gè)獨(dú)立的過(guò)程。目前主要是以熱凝膠產(chǎn)品為原料制備低分子量的熱凝膠，且多以制備熱凝膠寡糖為目的。已報(bào)道的制備低分子量熱凝膠(包括熱凝膠寡糖)主要有化學(xué)合成法、酸降解法、堿降解法及酶降解法?；瘜W(xué)合成法以葡萄糖單體為原料，步驟繁瑣，且多涉及到有毒試劑和有機(jī)試劑，產(chǎn)品分離困難且醫(yī)用范圍受到限制；酸降解法和堿降解法特異性低，降解效率不高，且容易引進(jìn)其它的雜質(zhì)；酶降解法雖然特異性高，但相應(yīng)酶的獲得較為困難，成本較高。上述這些方法雖然在制備低分子量熱凝膠方面取得了一些成果，但這些方法都有待改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種成本較低的高產(chǎn)低分子量熱凝膠的發(fā)酵方法。該方法以麩皮作為產(chǎn)熱凝膠階段的唯一氮源，將土壤桿菌ATCC 31749和哈茨木霉G頂3.442耦合進(jìn)行發(fā)酵，解除熱凝膠對(duì)土壤桿菌ATCC 31749的包裹，提高熱凝膠產(chǎn)量的同時(shí)，降低了熱凝膠的分子量，簡(jiǎn)化了制備低分子量熱凝膠的流程，降低了制備低分子量熱凝膠的成本。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案，一種高產(chǎn)低分子量熱凝膠的發(fā)酵方法，將篩選得到的高產(chǎn)熱凝膠菌株和熱凝膠內(nèi)切酶菌株分別培養(yǎng)，然后在高產(chǎn)熱凝膠菌株產(chǎn)熱凝膠的起始點(diǎn)，將二者按照一定比例混合，同時(shí)加入麩皮，通過(guò)過(guò)程優(yōu)化實(shí)現(xiàn)發(fā)酵法生產(chǎn)高產(chǎn)低分子量的熱凝膠;具體步驟為:
(I)從已報(bào)道的菌株中分別選擇高產(chǎn)熱凝膠菌株和熱凝膠內(nèi)切酶菌株;篩選得到理想的氮源； (2)將產(chǎn)生熱凝膠的高產(chǎn)熱凝膠菌株劃線接種于平板上，30°C培養(yǎng)2d，然后挑取單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，進(jìn)行14-18h的種子活化培養(yǎng);產(chǎn)熱凝膠內(nèi)切酶的熱凝膠內(nèi)切酶菌株劃線接種于平板上，30°C培養(yǎng)2d，然后挑取單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，進(jìn)行種子活化培養(yǎng)16-20h;將經(jīng)過(guò)種子活化培養(yǎng)的高產(chǎn)熱凝膠菌株及熱凝膠內(nèi)切酶菌株繼續(xù)分別按照5%的接種量接種于各自的發(fā)酵培養(yǎng)基中，均分別發(fā)酵培養(yǎng)16-18h;整個(gè)發(fā)酵培養(yǎng)溫度和轉(zhuǎn)速均分別為25-32°C和180-220 rpm；
所述熱凝膠內(nèi)切酶菌株種子培養(yǎng)基，按g/L計(jì)如下:葡萄糖，15-25;酵母膏10-20;(NH4)2S04,1.0-3.0；KH2PO4,4.0-8.0；MgSO4.7Η20，0.6-1.0;用純凈水配制；pH 6.5-7.5;
所述熱凝膠內(nèi)切酶菌株發(fā)酵培養(yǎng)基，按g/L計(jì)如下:茯苓多糖，10-30 ;麩皮，5-25 ;KH2PO4,2.5-7.5;MgSO4.7H20, 0.25-0.75;用純凈水配制；pH 6.5-7.5;
所述高產(chǎn)熱凝膠菌株種子培養(yǎng)基，按g/L計(jì)如下:葡萄糖，15-25 ；酵母膏8-15 ;ΚΗ2Ρ04，
1.5-2.5；MgSO4.7Η20，0.03-0.1;用純凈水配制；pH 6.5-7.5;
所述高產(chǎn)熱凝膠菌株發(fā)酵培養(yǎng)基，按g/L計(jì)如下:葡萄糖，60-100;酵母膏0.5-1.5;KH2PO4，2.0-4.0; (NH4)2SO4,1.0-3.05MgSO4.7H20,0.5-1.5；CaCO3,8-15；用純凈水配制；pH
6.5-7.5;
(3)將已發(fā)酵培養(yǎng)16-18h的熱凝膠內(nèi)切酶菌株，按照高產(chǎn)熱凝膠菌株:熱凝膠內(nèi)切酶菌株菌體干重比1:0.4-9.8加入到高產(chǎn)熱凝膠菌株中進(jìn)行耦合發(fā)酵，并加入麩皮10-30g/L，耦合發(fā)酵72-192h，整個(gè)發(fā)酵培養(yǎng)溫度和轉(zhuǎn)速均分別為25-32°C和180-220rpm，得到低分子量熱凝膠。
[0008]優(yōu)選的，步驟(I)中，選擇的產(chǎn)熱凝膠的菌株包括土壤桿菌屬，根瘤菌屬;選擇的產(chǎn)熱凝膠內(nèi)切酶的菌株包括木霉屬，毛霉屬。
[0009]優(yōu)選的，步驟(I)中，所述的獲得理想氮源是麩皮，其成本較低且在為哈茨木霉GM3.442產(chǎn)熱凝膠內(nèi)切酶提供氮源的同時(shí)，不影響土壤桿菌ATCC 31749產(chǎn)熱凝膠。
[0010]優(yōu)選的，步驟(3)中，所述的加入麩皮及已發(fā)酵培養(yǎng)16-18h的哈茨木霉GM3.442的時(shí)間是土壤桿菌ATCC 31749開始產(chǎn)熱凝膠時(shí)。
[0011]步驟(3)中，當(dāng)高產(chǎn)熱凝膠菌株發(fā)酵培養(yǎng)16-18h后，將已發(fā)酵培養(yǎng)16-18h的熱凝膠內(nèi)切酶菌株按照高產(chǎn)熱凝膠菌株:熱凝膠內(nèi)切酶菌株菌體干重比1: 1.4-4.2進(jìn)行耦合，并加入麩皮10_30g/L，耦合發(fā)酵至128-160h，耦合發(fā)酵過(guò)程的pH范圍是6.5-8.0，得到低分子量熱凝膠。
[0012]所述低分子量熱凝膠的分子量為10_93kDa，產(chǎn)量為15_52g/L。
[0013]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明以廉價(jià)的麩皮作為原料之一，在提高發(fā)酵法生產(chǎn)熱凝膠產(chǎn)量的同時(shí)，降低了熱凝膠的分子量，省去了復(fù)雜的熱凝膠內(nèi)切型分解酶的提取純化過(guò)程，獲得的低分子量熱凝膠降低了以熱凝膠為原料制備熱凝膠寡糖的成本，同時(shí)為提高其他多糖的產(chǎn)量及降低其分子量提供了新的方法。
[0014]本發(fā)明采用的菌株土壤桿菌ATCC 31749和哈茨木霉GM 3.442均已公開。參考文件1、[ “產(chǎn)膠期溶氧水平對(duì)土壤桿菌ATCC 31749發(fā)酵產(chǎn)熱凝膠流變性質(zhì)的影響”李晶，徐敏，朱莉，鄭志永，詹曉北，食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)2013年第32卷第12期];參考文件2:[“兩階段PH和攪拌控制策略提高哈茨木霉產(chǎn)β_1，3-葡聚糖內(nèi)切酶”李珊，詹曉北，鄭志永，朱莉，李晶，徐敏，食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)2015年第34卷第1149頁(yè)]。
【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1高產(chǎn)低分子量熱凝膠的發(fā)酵工藝流程。
【具體實(shí)施方式】
[0016]土壤桿菌ATCC 31749保存于江南大學(xué)糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈茨木霉G頂3.442購(gòu)自廣東菌種保藏中心；Silica gel 60 F254薄層層析板購(gòu)自Merck KGaA；標(biāo)準(zhǔn)分子量葡聚糖和茯苓多糖購(gòu)自Sigma公司，其余試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Sigma 2K5S離心機(jī)購(gòu)自Sigma公司，SHpH_6恒溫?fù)u床購(gòu)自上海國(guó)強(qiáng)生物工程設(shè)備有限公司。
[0017]下面結(jié)合說(shuō)明書附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0018]實(shí)施例1
將保存的土壤桿菌ATCC 31749及哈茨木霉GM 3.442劃線接種于平板上，30°C分別培養(yǎng)2d及4d，然后挑取單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，30°C、200 rpm分別培養(yǎng)16h及18h，最后按照5%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，均在30°C、200 rpm培養(yǎng)16h。
[0019]所述熱凝膠內(nèi)切酶菌株種子培養(yǎng)基，按g/L計(jì)如下:葡萄糖，15-25;酵母膏10-20;(NH4)2S04,1.0-3.0；KH2PO4,4.0-8.0；MgSO4.7Η20，0.6-1.0;用純凈水配制；pH 6.5-7.5;
所述熱凝膠內(nèi)切酶菌株發(fā)酵培養(yǎng)基，按g/L計(jì)如下:茯苓多糖，10-30 ;麩皮，5-25 ;KH2PO4,2.5-7.5;MgSO4.7H20, 0.25-0.75;用純凈水配制；pH 6.5-7.5;
所述高產(chǎn)熱凝膠菌株種子培養(yǎng)基，按g/L計(jì)如下:葡萄糖，15-25 ；酵母膏8-15 ;ΚΗ2Ρ04，
1.5-2.5；MgSO4.7Η20，0.03-0.1;用純凈水配制；pH 6.5-7.5;
所述