基于網(wǎng)絡(luò)型核酸納米探針的酶循環(huán)放大檢測(cè)dna的比色法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬于生化分析技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及基于網(wǎng)絡(luò)型核酸納米探針的酶循環(huán)放大檢測(cè)DNA的比色法。
【背景技術(shù)】
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[0002]納米材料具有表面效應(yīng)、體積效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、光學(xué)、電子學(xué)等諸多領(lǐng)域?；诩{米材料所構(gòu)建的納米探針在分析化學(xué)，特別是生物分析化學(xué)等方面具有重要作用。目前常用的納米探針有量子點(diǎn)、納米金、磁性顆粒等。其中，基于核酸自組裝所構(gòu)建的納米探針具有易標(biāo)記、設(shè)計(jì)靈活、結(jié)構(gòu)多樣、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子的識(shí)別、信號(hào)的轉(zhuǎn)換和放大等，在生物傳感等領(lǐng)域具有重要作用和廣闊的應(yīng)用前景。
[0003]酶循環(huán)放大技術(shù)是采用工具酶進(jìn)行的循環(huán)反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中被測(cè)物濃度擴(kuò)增，從而提高檢測(cè)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)被測(cè)物的高靈敏檢測(cè)，在生物分子檢測(cè)方面具有突出的優(yōu)勢(shì)。
[0004]比色法是通過(guò)比較或測(cè)量反應(yīng)體系溶液顏色變化來(lái)確定待測(cè)組分含量的方法。通過(guò)定量測(cè)定反應(yīng)液吸光度的變化，可提高測(cè)定的準(zhǔn)確度，且無(wú)需復(fù)雜的儀器設(shè)備，簡(jiǎn)單便捷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明結(jié)合兩種信號(hào)放大技術(shù):適體自組裝網(wǎng)絡(luò)型核酸納米探針和酶循環(huán)放大技術(shù)，以達(dá)到對(duì)靶DNA的痕量檢測(cè)。其設(shè)計(jì)原理為:將三叉DNAl和三叉DNA2的末端分別設(shè)計(jì)為能夠特異性識(shí)別凝血酶的適體序列I和適體序列2，使兩種三叉DNA通過(guò)與凝血酶的特異性結(jié)合互相連接，形成網(wǎng)絡(luò)型結(jié)構(gòu)。其中，適體序列I和適體序列2又為富G序列，在與凝血酶特異性識(shí)別后，無(wú)需外加任何DNA，即可與氯化血紅素形成大量過(guò)氧化物模擬酶，進(jìn)而作為免標(biāo)記核酸納米探針，催化反應(yīng)底物產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)。
[0006]在96孔板表面包被戊二醛，通過(guò)共價(jià)方法固定捕獲探針，該捕獲探針需提前退火，以形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)；加入待測(cè)液，當(dāng)有靶DNA存在時(shí)，靶DNA與捕獲探針的莖環(huán)部分互補(bǔ)配對(duì)，從而將捕獲探針打開(kāi);加入探針DNA，探針DNA—端可與被打開(kāi)的捕獲探針末端互補(bǔ)配對(duì);加入聚合酶、內(nèi)切酶和dNTPs，在聚合酶的作用下，探針DNA沿捕獲探針生長(zhǎng)，將靶DNA取代，被取代的靶DNA進(jìn)入新一輪反應(yīng);在內(nèi)切酶和聚合酶的作用下，發(fā)生剪切-復(fù)制反應(yīng)，生成新的靶DNA，進(jìn)而引發(fā)新的反應(yīng)。因此，當(dāng)有靶DNA存在時(shí)，通過(guò)此循環(huán)放大過(guò)程，極大地?cái)U(kuò)增了靶DNA的量。加入凝血酶和氯化血紅素，探針DNA的另一端為凝血酶適體序列，可與凝血酶特異性結(jié)合；由于凝血酶適體序列為富G序列，在凝血酶的作用下，適體序列與氯化血紅素形成過(guò)氧化物模擬酶;加入預(yù)先退火制備的三叉DNAl和三叉DNA2，通過(guò)凝血酶相互連接形成網(wǎng)絡(luò)型結(jié)構(gòu)；網(wǎng)絡(luò)型結(jié)構(gòu)中的適體序列與氯化血紅素結(jié)合，形成大量過(guò)氧化物模擬酶，催化反應(yīng)底物產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)。因此，在DNA聚合酶和DNA內(nèi)切酶的作用下，通過(guò)靶DNA引發(fā)復(fù)ffjij-剪切反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)靶DNA的擴(kuò)增；進(jìn)一步在凝血酶、三叉DNAl和三叉DNA2的作用下，形成網(wǎng)絡(luò)型結(jié)構(gòu)。當(dāng)有氯化血紅素存在時(shí)，形成大量過(guò)氧化物模擬酶，催化3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫反應(yīng)體系，生成藍(lán)色溶液，在650nm處產(chǎn)生紫外-可見(jiàn)吸收信號(hào)；反之，當(dāng)無(wú)靶DNA存在時(shí)，生成無(wú)色溶液，在650nm處無(wú)法產(chǎn)生紫外-可見(jiàn)吸收信號(hào)。通過(guò)本方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶DNA的超高靈敏檢測(cè)，無(wú)需復(fù)雜儀器設(shè)備，簡(jiǎn)單易行。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0008]一種基于網(wǎng)絡(luò)型核酸納米探針的酶循環(huán)放大檢測(cè)DNA的比色法，包括:
[0009]設(shè)計(jì)與靶DNA特異性結(jié)合后，能與探針DNA互補(bǔ)配對(duì)的捕獲探針；
[0010]向固定后的捕獲探針中依次加入靶DNA、探針DNA、DNA聚合酶、DNA內(nèi)切酶，引發(fā)復(fù)制-剪切反應(yīng)，使靶DNA進(jìn)行循環(huán)放大，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增；
[0011]向上述體系中繼續(xù)加入凝血酶、氯化血紅素，探針DNA與凝血酶特異性識(shí)別，進(jìn)而與氯化血紅素結(jié)合，形成過(guò)氧化物模擬酶；
[0012]再向上述體系中加入能夠通過(guò)凝血酶相互連接形成網(wǎng)絡(luò)型結(jié)構(gòu)的三叉DNA;所述三叉DNA分為兩類，分別為三叉DNAl和三叉DNA2，所述三叉DNAl的末端為能夠特異性識(shí)別凝血酶識(shí)別位點(diǎn)I的適體序列I，所述三叉DNA2的末端為能夠特異性識(shí)別凝血酶識(shí)別位點(diǎn)2的適體序列2;
[0013]網(wǎng)絡(luò)型結(jié)構(gòu)中的凝血酶適體序列與氯化血紅素結(jié)合，形成大量過(guò)氧化物模擬酶；
[0014]向上述產(chǎn)物中加入相應(yīng)的底物，采用比色法對(duì)靶DNA進(jìn)行檢測(cè)；
[0015]所述凝血酶含有兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，分別為凝血酶識(shí)別位點(diǎn)I和凝血酶識(shí)別位點(diǎn)2;
[0016]所述三叉DNA末端的適體序列I或適體序列2皆含有富G序列;在與凝血酶特異性識(shí)別后，能與氯化血紅素結(jié)合，形成大量過(guò)氧化物模擬酶，催化反應(yīng)底物產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)。
[0017]所述探針DNA—端為能夠特異性識(shí)別“凝血酶識(shí)別位點(diǎn)I或2”的適體序列。
[0018]優(yōu)選的，所述捕獲探針為莖環(huán)結(jié)構(gòu)，與靶DNA特異性結(jié)合后，莖環(huán)結(jié)構(gòu)被打開(kāi)，被打開(kāi)的莖環(huán)末端可與探針DNA互補(bǔ)配對(duì)。
[0019]優(yōu)選的，所述適體序列1為5’-6611^^^^^6611^6-3’；
[0020]優(yōu)選的，所述適體序列2為5’ -AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3 ’。
[0021]優(yōu)選的，所述捕獲探針的序列為:
[0022]5，-CCGCCGTTGAACACCATTGTCACACCCTCAGCAACGGCGG-3，；
[0023]優(yōu)選的，所述靶DNA序列為:
[0024]5’-TGGAGTGTGACAATGGTGTTTG-3’；
[0025]優(yōu)選的，所述三叉DNAl的序列為:
[0026]1)5，-GGTTGGTGTGGTTGGTGGATCCGCATGACATTCGCCGTAAGGTC-3’；
[0027]2)5，-GGTTGGTGTGGTTGGCTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCTGTC-3，；
[0028]3)5，-GGTTGGTGTGGTTGGAGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCAGTC-3，；
[0029]優(yōu)選的，三叉DNA2的序列為:
[0030]I)
[0031]5 ’-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTTGGATCCGCATGACATTCGCCGTAAGGTC-3’；
[0032]2)
[0033]5’-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTCTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCTGTC-3’；
[0034]3)
[0035]5 ’-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTAGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCAGTC-3’。
[0036]本發(fā)明還提供了一種基于網(wǎng)絡(luò)型核酸納米探針的酶循環(huán)放大檢測(cè)DNA的試劑盒，包括:
[0037]能與靶DNA特異性結(jié)合的捕獲探針；
[0038]探針DNA，所述探針DNA—端為能夠特異性識(shí)別“凝血酶識(shí)別位點(diǎn)I或2”的適體序列，另一端為能夠與被靶DNA打開(kāi)的捕獲探針互補(bǔ)配對(duì)的序列；
[0039]能夠通過(guò)凝血酶相互連接形成網(wǎng)絡(luò)型結(jié)構(gòu)的三叉DNA;所述三叉DNA分為兩類，分別為三叉DNAl和三叉DNA2，所述三叉DNAl的末端為能夠特異性識(shí)別凝血酶識(shí)別位點(diǎn)I的適體序列I，所述三叉DNA2的末端為能夠特異性識(shí)別凝血酶識(shí)別位點(diǎn)2的適體序列2;
[0040]凝血酶、氯化血紅素、DNA聚合酶、DNA內(nèi)切酶；
[0041]所述凝血酶含有兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，分別為凝血酶識(shí)別位點(diǎn)I和凝血酶識(shí)別位點(diǎn)2;
[0042]所述三叉DNA末端的適體序列I或適體序列2皆含有富G序列。在與凝血酶特異性識(shí)別后，能與氯化血紅素結(jié)合，形成大量過(guò)氧化物模擬酶，催化反應(yīng)底物產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)。
[0043]優(yōu)選的，所述捕獲探針為莖環(huán)結(jié)構(gòu)，與靶DNA特異性結(jié)合后，莖環(huán)結(jié)構(gòu)被打開(kāi)，被打開(kāi)的莖環(huán)末端可與探針DNA互補(bǔ)配對(duì)。
[0044]優(yōu)選的，所述適體序列I為5 ’ -GGTTGGTGTGGTTGG-3 ’ ；
[0045]優(yōu)選的，所述適體序列2為5’ -AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3 ’。
[0046]優(yōu)選的，所述捕獲探針的序列為:
[0047 ] 5’-CCGCCGTTGAACACCATTGTCACACCCTCAGCAACGGCGG-3’；
[0048]優(yōu)選的，所述靶DNA序列為:
[0049]5’-TGGAGTGTGACAATGGTGTTTG-3’；
[0050]優(yōu)選的，所述三叉DNAl的序列為:
[0051 ] 1)5’-GGTTGGTGTGGTTGGTGGATCCGCATGACATTCGCCGTAAGGTC-3’；
[0052]2)5，-GGTTGGTGTGGTTGGCTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCTGTC-3’；
[0053]3)5，-GGTTGGTGTGGTTGGAGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCAGTC-3，；
[0054]優(yōu)選的，三叉DNA2的序列為:
[0055]I)
[0056]5’-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTTGGATCCGCATGACATTCGCCGTAAGGTC-3’；
[0057]2)
[0058]5’-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTCTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCTGTC-3’；
[0059]3)
[0060]5’-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTAGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCAGTC-3’。
[0061]本發(fā)明還提供了一種基于網(wǎng)絡(luò)型核酸納米探針的酶循環(huán)放大檢測(cè)DNA的裝置，包括上項(xiàng)任一所述的試劑盒。
[0062]本發(fā)明還提供了一種網(wǎng)絡(luò)型過(guò)氧化物模擬酶納米結(jié)構(gòu)放大檢測(cè)信號(hào)的方法，包括:
[0063]加入能夠通過(guò)凝血酶相互連接形成網(wǎng)絡(luò)型結(jié)構(gòu)的三叉DNA;所述三叉DNA分為兩類，分別為三叉DNAl和三叉DNA2，所述三叉DNAl的末端為能夠特異性識(shí)別凝血酶識(shí)別位點(diǎn)I的適體序列I，所述三叉DNA2的末端為能夠特異性識(shí)別凝血酶識(shí)別位點(diǎn)2的適體序列2;加入凝血酶和氯化血紅素;所述凝血酶含有兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，分別為凝血酶識(shí)別位點(diǎn)I和凝血酶識(shí)別位點(diǎn)2，在凝血酶作用下，三叉DNA中的適體序列I和適體序列2與凝血酶特異性識(shí)別，進(jìn)而與氯化血紅素結(jié)合，形成網(wǎng)絡(luò)型過(guò)氧化物模擬酶納米結(jié)構(gòu)，催化反應(yīng)底物，放大檢測(cè)信號(hào)；
[0064]所述三叉DNA末端的適體序列I和適體序列2皆含有富G序列。
[0065]本發(fā)明的有益效果:
[0066]在本研究工作中，我們第一次嘗試將適體自組裝網(wǎng)絡(luò)型核酸納米探針與酶循環(huán)放大技術(shù)相結(jié)合，建立了一種比色法檢測(cè)靶DNA的方法，具有靈敏度高，選擇性好，簡(jiǎn)單快速，價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。其中，適體自組裝網(wǎng)絡(luò)型核酸納米探針可將信號(hào)放大10倍以上，酶循環(huán)放大技術(shù)可將信號(hào)放大100倍以上。將兩種信號(hào)放大技術(shù)相結(jié)合，可將檢測(cè)信號(hào)放大1000倍以上，極大地提高了檢測(cè)靈敏度，對(duì)靶DNA的檢出限為10—15M,靈敏度遠(yuǎn)高于其他比色法。由于三叉DNA的凝血酶適體序列中含有富G序列，在與凝血酶特異性識(shí)別形成網(wǎng)絡(luò)型結(jié)構(gòu)后，無(wú)需外加任何DNA，即可與氯化血紅素形成大量過(guò)氧化物模擬酶，進(jìn)而作為免標(biāo)記核酸納米探針，催化反應(yīng)底物產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)。此外，通過(guò)使用其他配體識(shí)別機(jī)制，如核酸適體識(shí)別等，該方法可以擴(kuò)展到其他生物分子的檢測(cè)，如蛋白類、小分子類、甚至腫瘤細(xì)胞等生物標(biāo)志物的檢測(cè)，在疾病診療等方面具有巨大的應(yīng)用前景和發(fā)展?jié)摿Α?br>【附圖說(shuō)明】
[0067]圖1采用所構(gòu)建的方法檢測(cè)不同濃度靶DNA得到的紫外-可見(jiàn)光譜圖。
[0068]圖2采用所構(gòu)建的方法檢測(cè)錯(cuò)配靶DNA得到的紫外-可見(jiàn)光譜圖。
[0069]圖3本發(fā)明的原理圖。
【具體實(shí)施方式】
[0070]下面結(jié)合附圖與實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0071]實(shí)施例1
[0072]實(shí)驗(yàn)步驟:
[0073](I)捕獲探針退火形成莖環(huán):90°C加熱lOmin，緩慢降至室溫后保持2h。
[0074](捕獲探針序列:
[0075]5’-CCGCCGTTGAACACCATTGTCACACCCTCAGCAACGGCGG-3’)
[0076](2)在96孔板的5個(gè)微孔中加入200yL 5mM戊二醛，將96