與日本囊對蝦耐熱性相關的snp標記及其檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及水產養(yǎng)殖中的蝦類耐熱群體的檢測，尤其是涉及一種與日本囊對蝦耐 熱性相關的SNP標記及其檢測方法。
【背景技術】
[0002] 日本囊對it!下(Marsupenaeus japonicus)的英文名為Kuruma shrimp，俗稱斑節(jié)!ti下、 竹節(jié)蝦、花尾蝦、藍尾蝦，是中國海水蝦類養(yǎng)殖的重要種類。日本囊對蝦屬亞熱帶種類，最適 溫度范圍為25~30°C，在8~10°C停止攝食，5°C以下死亡，高于32°C生活不正常。日本囊對 蝦的養(yǎng)殖受溫度影響明顯，超過一定的水溫臨界值，會造成較大面積死亡，在南方地區(qū)夏季 高溫養(yǎng)殖受限。近年來，為了提高日本囊對蝦的生長速度和養(yǎng)殖效率，已有養(yǎng)殖戶嘗試在高 溫后期適當提前放苗，但目前缺少耐高溫性狀的評價方法以及高溫養(yǎng)殖的技術標準，提前 放苗的養(yǎng)殖結果很不穩(wěn)定。因此亟需深入了解日本囊對蝦的耐高溫性狀，為南方地區(qū)的高 溫季節(jié)養(yǎng)殖和耐高溫品系的選育積累生物學資料。
[0003] 國內外關于蝦類的耐溫研究見于南極磷蝦、羅氏沼蝦、中國對蝦等，開展了溫度對 蝦類代謝率、臨界溫度、耗氧率等影響的研究。在日本囊對蝦方面，有學者報道了溫度對消 化酶活性、生長和成活率(江敏，臧維玲.溫度對日本對蝦幼蝦生長與耗氧的影響[J].漁業(yè) 現代化，2002(3) :14-16.)的影響以及成蝦和仔蝦(李潤寅，陳介康，姜洪亮，等.日本對蝦仔 蝦的溫度適宜性實驗研究[J].水產科學，2001，20(3): 17-18)對溫度適應性的差異。單核苷 酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms，SNP)即指基因組水平上由單個核苷酸的變 異所引起的DNA序列多態(tài)性，作為第三代分子標記，具有數量眾多、分布廣泛、遺傳穩(wěn)定性更 高、分型方法簡易等優(yōu)勢，已經在育種領域具有十分重要的應用價值。在水產動物中研究人 員篩選了一系列跟生長、抗病、抗逆相關的SNP分子標記。在日本囊對蝦耐熱方面的研究中， 很少有耐熱相關SNP篩選與檢測的報道。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種與日本囊對蝦耐熱性相關的SNP標記及其檢測方法。
[0005] 本發(fā)明首先利用直接測序法提供一種與日本囊對蝦熱耐受性相關的SNP標記，所 述與日本囊對蝦耐熱性相關的SNP標記是核酸序列為SEQ ID NO. 1的HSP60基因的第3289位 點，其堿基為A或G。
[0006] 本發(fā)明還提供一種聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)檢測方法，對直接測 序法得到的MjHSP60基因 3289A/G進行檢測，確定該位點與熱耐受性狀的相關性。
[0007] 用于PCR-RFLP檢測的引物，其上下游序列分別為：
[0008] HSP60NF5：CCGTGGCTACATCTCGC；
[0009] HSP60NR5:TCTTCAAGCGGTTCACTACA。
[0010] 與日本囊對蝦耐熱性相關的SNP標記的檢測方法，包括以下步驟：
[0011 ] 1)日本囊對蝦耐熱性實驗步驟；
[0012] 2)熱耐受值(Upper thermal tolerance，UTT)的計算步驟；
[0013 ] 3)利用PCR-RFLP技術進行基因分型步驟；
[0014] 4)不同基因型日本囊對蝦個體熱耐受性分析步驟。
[0015] 在步驟1)中，所述日本囊對蝦耐熱性實驗步驟如下：
[0016] 將日本囊對蝦在33°C水體中暫養(yǎng)Id后，以l°C/2h的速率升溫直至所有對蝦死亡， 找出38°C為死亡率較高拐點；以33°C為初始溫度，選取經Id暫養(yǎng)正常的個體放入實驗池，以 l°C/2h的速率升溫至38°C;38°C之后以0.5°C/4h的速率升溫直至所有日本囊對蝦死亡;實 驗中保持充氣，以確保水池中各個部位溫度同步;對蝦死亡標準為對蝦背部朝下倒于水體 無法恢復正常的姿勢或軀體始終保持90°彎曲；記錄死亡時間、死亡溫度、體重，然后裝入封 口袋中，以供實驗結束后保存樣品，保證每l〇min撈取一次死蝦并做好記錄，當池子中對蝦 死亡總數達到100 %時結束耐熱實驗。
[0017] 在步驟2)中，所述熱耐受值(Upper thermal tolerance,UTT)的計算按以下公式： [0018] ?-Ι
[0019]式中，i為分鐘數，Ti為在第i分鐘的溫度，To為實驗初始溫度33°C，k為個體存活的 分鐘數。
[0020]在步驟3)中，所述利用PCR-RFLP技術進行基因分型的具體方法可為：
[0021] a)隨機選取40~80尾體重在2.3~3.3g之間的已獲得熱耐受性狀評定指標UTT值 的日本囊對蝦，取每尾蝦的背部肌肉，置于無水乙醇中，-20°C保存，用于基因組DNA的提取。 提取基因組DNA后，利用特異性引物HSP60F5和HSP60R5進行PCR擴增，擴增產物經限制性內 切酶Bstn酶切，根據酶切后電泳條帶確定不同的基因型。酶切體系如下：
[0022]
[0023] 反應條件:37°C水浴，15min;
[0024] b)利用PCR-RFLP方法對SNP標記3289A/G進行分型，經BstXI酶切后，3289A型等位 基因產生長度分別為333bp和68bp的兩種片段，而3289G由于不能為酶所識別，基因片 段長度仍為401bp;酶切產物經1.5%電泳檢測后，發(fā)現存在2種基因型：3289AA基因型和 3289AG基因型。
[0025] 在步驟4)中，所述不同基因型日本囊對蝦個體熱耐受性分析的具體方法為：
[0026]對具不同基因型的日本囊對蝦個體(2.3~3.3g)進行熱耐受性方差分析對比。 [0027] 本發(fā)明利用直接測序法、PCR-RFLP法給出MjHSP60基因多態(tài)性，并對SNP多態(tài)性與 日本囊對蝦熱耐受性進行關聯分析，為篩選耐高溫的SNP分子標記，開展日本囊對蝦耐熱品 系的分子育種提供理論參考。
【附圖說明】
[0028]圖1為日本囊對蝦及擬穴青蟹HSP60基因組織結構圖對比。在圖1中，方框代表外顯 子，直線代表內含子。
[0029]圖2為位點3289A/G不同基因型電泳結果圖。
【具體實施方式】
[0030] 本發(fā)明根據日本囊對蝦MjHSP60mRNA(GenBank登錄號：JQ972715.1)和擬穴青蟹 (3〇711&口&瓜111&1]1〇8&;[11)批?60基因全序列(66111^111<:登錄號:幾 262230.1)，在相鄰外顯子兩 端設計引物，最后利用交叉引物驗證是否有未擴出的內含子。通過對所有擴增片段的重疊 比對和拼接獲得MjHSP60基因。該基因 DNA全長4637bp，共含8個外顯子和7個內含子，其中 0RF長度為1740bp，編碼579個氨基酸。
[0031]本發(fā)明根據M jHSP60基因 SNP多態(tài)性與日本囊對蝦熱耐受性的相關性，初步篩選出 第3289位點，其堿基為A或G。并利用PCR-RFLP技術對其驗證，其結果可為日本囊對蝦耐熱遺 傳育種奠定基礎。
[0032]下面結合具體實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。
[0033] 實施例1:日本囊對蝦HSP60基因 cDNA和DNA序列克隆，包括以下步驟：
[0034] 1)日本囊對蝦肌肉DNA的提??；
[0035] 2)HSP60基因內含子的擴增；
[0036] 3)獲得MjHSP60目的基因全長序列。
[0037]在步驟1)中，所述日本囊對蝦肌肉DNA的提取的具體方法可為:用酚/氯仿抽提，再 瓊脂糖TBE凝膠電泳檢測DNA。
[0038]在步驟2)中，所述HSP60基因內含子的擴增的具體方法可為：
[0039] a)引物設計
[0040] 根據日本囊對蝦MjHSP60mRNA(GenBank登錄號：JQ972715.1)和擬穴青蟹（Scylla paramamosain)HSP60基因全序列(GenBank登錄號:JX262230.1)，在相鄰外顯子兩端設計引 物，最后利用交叉引物驗證是否有未擴出的內含子。MjHSP60內含子擴增所用引物序列如表 1所示。
[0041]表1
[0042]
[0043] b)PCR擴增，反應體系如下：
[0044]
[0045] c)PCR擴增程序：①95°C5min;②30個循環(huán)：94°C30sec，退火溫度30sec，72°C 30sec;③72°C10min;④4°CPause。注:PCR擴增根據不同的引物分別設置相應的退火溫度。 取5yL PCR加樣于1.5%瓊脂糖凝膠，在0.5 X TBE的緩沖體系中以160V電壓進行電泳，30min 后，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照，查看目的條帶。
[0046] d)PCR產物的回收和純化、感受態(tài)細胞的制備、目的片段與pMD 19-T Vector連接、 重組質粒的轉化；
[0047] e)重組子的PCR鑒定與序列測定
[0048]每個目的片段的克隆平板隨機挑取8個菌落，分別置于含有Amp(100yg/mL)的700μ L LB液體培養(yǎng)基中，37°C、180rpm振蕩培養(yǎng)4h，以每管菌液作為模板，采用pMD19-T通用引物 進行PCR擴增鑒定。反應體系如下：
[0049]
[0050] f)PCR擴增程序：①95。C5min;②30個循環(huán)：94。C30sec，55。C30sec，72。Clmin ;③72 °C10min;④4°CPauSe<3PCR檢測陽性菌液送交華大基因公司進行測序，通過對所有擴增片段 和引物序列的重疊比對和拼接獲得MjHSP60基因編碼區(qū)全長序列。
[0051] 在步驟3)中，所述獲得MjHSP60目的基因全長序列的具體方法可為：
[0052]通過對所有擴增片段的重疊比對、拼接獲得MjHSP60基因編碼區(qū)全長序列（參見圖 1)。該基因共含8個外顯子和7個內含子，其基因組織結構圖與擬穴青蟹較為一致，從圖1中 可以看出，二者的外顯子分布和大小幾乎一致，對兩者外顯子進行BLAST比對發(fā)現相似度達 94%，而內含子差異較大。
[0053]實施例2:日本囊對蝦HSP60基因中與耐熱性相關SNP標記的篩選，包括步驟如下：
[0054] 1)實驗對蝦
[0055] 基因組DNA的提?。ㄍ希?br>[0056] 2)不同群體日本囊對奸M jHSP60基因 SNP檢測
[0057] a)利用直接測序法進行SNP的篩選