一種藍細菌脂肪烴合成關鍵基因及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及能源微生物種質(zhì)資源與基因資源領域，具體而言是一種藍細菌脂肪姪 合成關鍵基因。
【背景技術】
[0002] 能源是現(xiàn)代工業(yè)的支柱，W化石燃料為代表的傳統(tǒng)能源的日益短缺是制約我國經(jīng) 濟可持續(xù)發(fā)展的瓶頸，可再生的生物燃料的應用成為緩解能源危機并改善生態(tài)環(huán)境的最佳 選擇之一。在交通運輸業(yè)中廣泛使用的汽油、柴油和航空煤油等化石燃料的主要成分是特 定鏈長范圍的脂肪姪，脂肪姪具有高能量密度、低吸濕性、低揮發(fā)性、與現(xiàn)有發(fā)動機相兼容 等優(yōu)點，是傳統(tǒng)石化液體燃料的最佳替代品化easling and化OU 2008)。
[0003] 石油、古代沉積物W及隅石中包含了大量可能為生物來源的物質(zhì)，其中脂肪姪也 是最受關注的成員之一?？茖W家曾針對傳統(tǒng)化石能源的起源提出了腐朽的藻類細胞是其組 成成分的理論（Han and Calvin 1969)。而自上世紀六十年代末期開始的關于藍細菌中脂 肪姪的研究主要是圍繞分析和鑒定不同藍細菌（或者其他真核藻類）的脂肪姪組成和含 量展開的。目前已報道的野生藍細菌中脂肪姪含量最低占細胞干重的0.01% (Winters et al. 1969)，最高可達0.26% (Coates et al. 2014)。研究發(fā)現(xiàn)其鏈長主要集中于C15至C20 之間，且W C17為主化an et al. 1968)。
[0004] 作為新一代能源微生物系統(tǒng)，藍細菌具有W下優(yōu)勢；（1)與合成生物燃料的異養(yǎng) 微生物反應器大腸桿菌、釀酒酵母等不同，藍細菌能夠利用太陽能并可W二氧化碳作為碳 源生長，具備種類豐富、培養(yǎng)成本低、生命力強、生長速率快等優(yōu)點。（2)從基因工程角度考 慮，與同樣可利用太陽能和二氧化碳的真核微藻、高等植物不同，藍細菌作為合成脂肪姪的 宿主，其基因操作更為簡易，可進行大規(guī)模的遺傳改造。（3)藍細菌具有相對清晰的遺傳背 景。目前已公布了 130余株藍細菌的全基因組序列（Shih et al. 2013)。
[0005] 得益于分子生物學、生物信息學和代謝工程技術等的迅猛發(fā)展，目前已經(jīng)在藍細 菌中鑒定出兩條脂肪姪合成途徑。其一存在于多數(shù)藍細菌中，主要由脂醜醜基載體蛋白 還原酶（Fatty a巧；L-ac}d carrier protein reductase, AAR)和脂肪醒脫甲醜基加氧酶 (Fatty aldehyde deformylating oxygenase, ADO)催化完成，其產(chǎn)物主要為直鏈焼姪、側 鏈焼姪和帰姪（不飽和鍵位于碳鏈內(nèi)部HSchirmer et al.2010)。另一途徑存在于少數(shù)藍 細菌中，主要由末端帰姪合成酶（terminal olefin synthase,化巧催化完成，其產(chǎn)物為末端 帰姪（不飽和鍵位于碳鏈末尾）（Mendez-Perez et al.2011)。
[0006] 基于上述脂肪姪合成途徑的鑒定，目前已通過基因工程改造和代謝工程優(yōu)化提高 了重組藍細菌的脂肪姪產(chǎn)量。W集胞藻PCC 6803為例，研究結果證實，重組菌株的產(chǎn)量已 可達野生株的9倍W上（Wang et al. 2013)。但目前基因工程藍細菌合成脂肪姪的水平還 遠未達到工業(yè)應用的水平，產(chǎn)姪藍細菌種質(zhì)資源和基因資源的挖掘是進一步提高藍細菌脂 肪姪合成效率與豐富產(chǎn)姪多樣性的重要因素之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明目的在于提供一種藍細菌脂肪姪合成關鍵基因。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為：
[0009] -種藍細菌產(chǎn)姪基因：產(chǎn)姪基因包括脂醜ACP還原酶的編碼基因（aar)和脂肪醒 脫甲醜基加氧酶的編碼基因（ado)。
[0010] 所述脂醜ACP還原酶的編碼基因（aar)和脂肪醒脫甲醜基加氧酶的編碼基因 (ado)為藍細菌 Nostoc calcicola FACHB 389，Leptolyngbya sp. NIES-30, Phormidium ambiguum NIES-2119, Chroogloeocystis siderophila NIES-1031， Calothrix sp. NIES-2101 或 Sc}ftonema sp. NIES-2130 的 aar 和 ado。
[0011] 所述脂醜ACP還原酶的編碼基因（aar)和脂肪醒脫甲醜基加氧酶的編碼基因 (ado)具有沈Q ID NO: 1 與 2、沈Q ID NO:3 與 4、沈Q ID NO:5 與 6、沈Q ID NO:7 與 8、沈Q ID NO:9與10或沈Q ID NO: 11與12所示的序列。
[0012] 一種構建體，構建體包含啟動子，W及該啟動子控制的脂醜ACP還原酶的編碼基 因（aar)和脂肪醒脫甲醜基加氧酶的編碼基因（ado)。
[0013] 所述構建體的啟動子為來源于藍細菌的化pcB啟動子或來源于大腸桿菌的T7啟 動子。
[0014] 所述脂醜ACP還原酶的編碼基因（aar)和脂肪醒脫甲醜基加氧酶的編碼基因 (ado)為藍細菌 Nostoc calcicola FACHB 389，Leptolyngbya sp.NIES-30, Phormidium ambiguum NIES-2119, Chroogloeocystis siderophila NIES-1031, Calothrix sp. NIES-2101 或 Sc}ftonema sp. NIES-2130 的 aar 和 ado。
[0015] 一種能合成脂肪姪的基因工程菌，工程菌包含上述構建體。
[0016] 進一步的說是，將所述構建體通過轉(zhuǎn)化導入大腸桿菌中。
[0017] 更進一步的說是，將所述構建體通過轉(zhuǎn)化導入大腸桿菌化21 (DE3)化祀突變株 中。
[0018] 一種所述的藍細菌產(chǎn)姪基因作為合成脂肪姪的應用中。
[0019] 本發(fā)明所具有的有益效果：
[0020] W藍細菌作為微生物表達系統(tǒng)合成脂肪姪，是利用太陽能固定二氧化碳合成生物 燃料的過程。該過程是清潔生物能源的生產(chǎn)過程，不受原料不足的制約，不會增加碳排放。 本發(fā)明的技術方案可為上述生物能源制備過程提供有價值的候選基因資源。
[0021] 同時，藍細菌產(chǎn)姪關鍵基因（脂醜ACP還原酶/脂肪醒脫甲醜基加氧酶編碼基因） 的克隆有W下重要作用；一、為從分子水平上深入研究藍細菌脂肪姪合成的代謝機制和藍 細菌胞內(nèi)脂肪姪的生理功能奠定了基礎。二、可了解不同藍細菌菌株的產(chǎn)姪特性，并解析不 同結構脂肪姪在藍細菌中的分布規(guī)律。
[0022] 因此，本發(fā)明通過廣泛收集藍細菌菌種資源，并借助全基因組測序和產(chǎn)姪基因克 隆，旨在為用太陽能、二氧化碳和水直接合成脂肪姪的藍細菌液體燃料合成體系提供候選 種質(zhì)和基因資源。
【附圖說明】
[0023] 圖1為基于GC-MS測定的藻株Nostoc calcicola FACHB 389的脂肪姪組成和特 性。
[0024] 圖2為基于GC-MS測定的藻株Leptolyngbya sp. NIES-30的脂肪姪組成和特性。 [00巧]圖3為基于GC-MS測定的藻株化ormidium ambiguum NIES-2119的脂肪姪組成和 特性。
[0026] 圖 4 為基于 GC-MS 測定的藻株 Qiroogloeo巧stis siderophila NIES-1031 的脂 肪姪組成和特性。
[0027] 圖5為基于GC-MS測定的藻株化lot虹ix sp. NIES-2101的脂肪姪組成和特性。
[0028] 圖6為基于GC-MS測定的藻株S^tonema sp. NIES-2130的脂肪姪組成和特性。
[0029] 圖7為重組載體PTZ60的基本結構。重組載體PTZ60是W 389-1/2為引物， WNostoc calcicola FACHB 389基因組DNA為模板，PCR擴增出2065bp片段，克隆入 pEASY-blunt載體，轉(zhuǎn)化E. coli Transl-Tl瞻菌體抗性感受態(tài)細胞而獲得。
[0030] 圖8為重組載體ρΤΖ61的基本結構。重組載體ρΤΖ61是W 30-1 /2為引物， W Leptolyngbya sp. NIES-30基因組DNA為模板，PCR擴增出1949bp片段，克隆入 pEASY-blunt載體，轉(zhuǎn)化E. coli Transl-Tl瞻菌體抗性感受態(tài)細胞而獲得。
[0031] 圖9為重組載體PTZ62的基本結構。重組載體PTZ62是W 2119-1/2為引物，W Phormidium ambiguum NIES-2119基因組DNA為模板，PCR擴增出1914bp片段，克隆入 pEASY-blunt載體，轉(zhuǎn)化E. coli Transl-Tl瞻菌體抗性感受態(tài)細胞而獲得。
[0032] 圖10為重組載體PTZ63的基本結構。重組載體PTZ63是W 1031-1/2為引物，W Qiroogloeo巧stis siderophila NIES-1031 基因組 DNA 為模板，PCR 擴增出 19nbp 片段， 克隆入pEASY-blunt載體，轉(zhuǎn)化E. coli Transl-Tl瞻菌體抗性感受態(tài)細胞而獲得。
[0033] 圖11為重組載體PTZ64的基本結構。重組載體PTZ64是W 2101-1/2為引物，W Calot虹ix sp. NIES-2101基因組DNA為模板，PCR擴增出183化P片段，克隆入祀ASY-blunt 載體，轉(zhuǎn)化E. coli Transl-Tl瞻菌體抗性感受態(tài)細胞而獲得。
[0034] 圖12為重組載體PTZ65的基本結構。重組載體PTZ65是W 2130-1/2為引物，W S巧tonema sp. NIES-2130基因組DNA為模板，PCR擴增出1887bp片段，克隆入祀ASY-blunt 載體，轉(zhuǎn)化E. coli化ansl-Tl瞻菌體抗性感受態(tài)細胞而獲得。
[0035] 圖13為重組載體ρΤΖ68的基本結構。WBamH I和化0 I酶切ρΤΖ60并回收Nostoc calcicola FACHB 389的產(chǎn)姪基因片段ado-aar, WBamH I和化〇 I酶切祀T2化并回收載 體部分，兩者連接構建獲得重組質(zhì)粒PTZ68。
[0036] 圖14為重組載體PTZ69的基本結構。W BamH I和化0 I酶切PTZ61并回收 Leptolyngbya sp.NIES-30 的產(chǎn)姪基因片段 ado-aar, WBamH I 和)(ho I 酶切祀T2化并回 收載體部分，兩者連接構建獲得重組質(zhì)粒PTZ69。
[0037] 圖15為重組載體PTZ70的基本結構。WBamH I和化0 I酶切PTZ62并回收 Phormidium ambiguum NIES-2119 的產(chǎn)姪基因片段ado-aar, WBamH I 和化〇 I 酶切祀T2化 并回收載體部分，兩者連接構建獲得重組質(zhì)粒PTZ70。
[0038] 圖16為重組載體PTZ71的基本結構。W BamH I和化0 I酶切PTZ63并回收 Qiroogloeoc^ystis siderophila NIES-1031 的產(chǎn)姪基因片