用輔助寡核苷酸電化學(xué)檢測(cè)的系統(tǒng)、方法和裝置的制造方法
【專利說明】用輔助寡核音酸電化學(xué)檢測(cè)的系統(tǒng)、方法和裝置
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)交叉引用 本申請(qǐng)要求2013年8月7日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/863,280的優(yōu)先權(quán)，所述申請(qǐng)全文通 過引用結(jié)合到本文中。
[0002] 序列表 本申請(qǐng)包含WASCII格式電子提交的序列表，全文通過引用結(jié)合到本文中。在2014年7 月25日創(chuàng)建的所述ASCII副本名為109904-0013-胖01_化.txt，1，316肺大小。
[000引背景 研發(fā)能夠W高靈敏度和特異性檢測(cè)核酸祀的低成本、高通過量傳感器非常理想。很多 標(biāo)準(zhǔn)診斷分析，例如細(xì)胞培養(yǎng)和利用PCR擴(kuò)增的基因檢驗(yàn)，需要將樣品送到實(shí)驗(yàn)室，并有數(shù) 天或數(shù)星期的長(zhǎng)周轉(zhuǎn)時(shí)間。在運(yùn)些情況下，很多患者不回到護(hù)理提供者處接收結(jié)果或接受 治療，在一些情況下，長(zhǎng)周轉(zhuǎn)可損及適當(dāng)治療疾病的能力。雖然快速現(xiàn)場(chǎng)護(hù)理分析在發(fā)展 中，但在運(yùn)些系統(tǒng)中難W實(shí)現(xiàn)減少假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果出現(xiàn)所必需的高靈敏性和特異性。 因此，提高靈敏性和特異性的替代系統(tǒng)和方法可有益于改進(jìn)現(xiàn)場(chǎng)護(hù)理應(yīng)用。
[0004] 概述 本文公開用輔助寡核巧酸(各自為輔助寡聚體或共同為輔助寡聚體）電化學(xué)檢測(cè)祀的 系統(tǒng)、裝置和方法。根據(jù)一個(gè)方面，為了提高電化學(xué)檢測(cè)的靈敏性，用輔助寡聚體(帶負(fù)電荷 的氨基酸序列)通過捕捉分子提高雜交到祀分子時(shí)存在的電荷的量。在一些實(shí)施方案中，輔 助寡聚體可雜交到RNA/DNA的一部分。然后，RNA/DNA祀可結(jié)合到相反互補(bǔ)性的電極結(jié)合PNA 探針。一旦結(jié)合到探針，整個(gè)復(fù)合體(祀和輔助序列)就增加電極表面的總電荷，運(yùn)增大檢測(cè) 信號(hào)的大小。在結(jié)合到祀時(shí)，輔助寡聚體可比無(wú)輔助寡聚體存在下祀結(jié)合到探針更加增加 表面電荷和檢測(cè)靈敏度。輔助寡聚體也可標(biāo)記到或連接到帶電荷部分，運(yùn)進(jìn)一步在與祀雜 交時(shí)增加電荷。另外，在檢測(cè)前施加包含祀的樣品時(shí)，輔助寡聚體可展開可部分不能接近探 針的DNA/RNA祀的區(qū)域，因此允許探針更有效結(jié)合到祀內(nèi)的所需序列。另外，通過展開祀序 列，輔助寡聚體可通過提高到祀序列的可接近性減小非特異結(jié)合效應(yīng)。
[0005] 附圖簡(jiǎn)述 通過研究W下詳述并結(jié)合附圖，前述和其它目的和優(yōu)點(diǎn)顯而易見，其中在全文中相似 的附圖標(biāo)記指相似部件，其中： 圖1描繪根據(jù)一些實(shí)施方案的電化學(xué)檢測(cè)祀的示意圖； 圖2描繪根據(jù)一些實(shí)施方案指示祀存在/不存在的電化學(xué)讀出； 圖3描繪根據(jù)一些實(shí)施方案的基于納米結(jié)構(gòu)微電極的電化學(xué)檢測(cè)器； 圖4A、4B、4C和4D描繪根據(jù)一些實(shí)施方案用輔助寡聚體電化學(xué)檢測(cè)的示意圖； 圖5A和5B描繪根據(jù)一些實(shí)施方案輔助寡聚體的酶促擴(kuò)延； 圖6A、6B和6C描繪根據(jù)一些實(shí)施方案輔助寡聚體用滾環(huán)擴(kuò)增來(lái)酶促擴(kuò)延； 圖7A和7B描繪根據(jù)一些實(shí)施方案用帶電荷部分標(biāo)記的輔助寡聚體； 圖8A和8B描繪根據(jù)一些實(shí)施方案用支化寡核巧酸結(jié)構(gòu)標(biāo)記的輔助寡聚體； 圖9A、9B、9C和9D描繪根據(jù)說明性實(shí)施方案的試驗(yàn)結(jié)果； 圖10描繪根據(jù)一些實(shí)施方案用輔助寡聚體進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)的室； 圖11描繪用輔助寡聚體檢測(cè)祀的說明性過程； 圖12描繪根據(jù)一些實(shí)施方案接收、制備和分析生物樣品的盒系統(tǒng)； 圖13描繪根據(jù)一些實(shí)施方案的分析檢測(cè)系統(tǒng)的盒;并且 圖14描繪根據(jù)一些實(shí)施方案的自動(dòng)檢驗(yàn)系統(tǒng)。
[0006] 詳述 為了全面理解本文所述系統(tǒng)、裝置和方法，將描述某些說明性實(shí)施方案。應(yīng)了解，本文 公開的系統(tǒng)、裝置和方法，雖然顯示用于檢測(cè)生物疾病標(biāo)記的診斷系統(tǒng)，但也可用于需要復(fù) 合電化學(xué)分析的其它系統(tǒng)。
[0007] 圖1-4描繪通過電化學(xué)方法檢測(cè)祀分析物的說明性工具、傳感器、生物傳感器和技 術(shù)，分析物包括細(xì)胞、分子或組織組分。圖1描繪用生物傳感器系統(tǒng)電化學(xué)檢測(cè)核巧酸鏈。系 統(tǒng)700包括電極702,該電極702具有通過連接體704連接到電極702的關(guān)聯(lián)探針706。探針706 為能夠結(jié)合到生物標(biāo)記祀(例如，受體、配體)或與其相互作用W指示樣品中配體或受體存 在的分子或分子團(tuán)，例如核酸（例如，DNA、RNA、cDNA、mRNA、rRNA等）、寡核巧酸、膚核酸 (PNA)、鎖定核酸、蛋白（例如，抗體、酶等)或膚。連接體704為例如通過化學(xué)鍵(例如，硫醇 鍵)使探針706連結(jié)到電極702的分子或分子團(tuán)。
[0008] 在一些實(shí)施方案中，探針706為能夠通過一個(gè)或多個(gè)類型化學(xué)鍵結(jié)合到祀核酸序 列的多核巧酸，所述化學(xué)鍵例如互補(bǔ)堿基配對(duì)和氨鍵形成。也將此結(jié)合稱為雜交或復(fù)性。例 如，探針706可包括天然產(chǎn)生的核巧酸和核巧堿，例如腺嚷嶺(A)、鳥嚷嶺(G)、胞喀晚(C)、胸 腺喀晚(T)和尿喀晚化)或改性堿(例如7-脫氮鳥巧和肌巧）。探針706中的堿可通過憐酸二 醋鍵（例如，DNA和RNA分子)或用其它類型鍵連接。例如，探針706可W為膚核酸(PNA)低聚 體，其中組成堿通過膚鍵連接，而不是憐酸二醋鍵。膚核酸(PNA)低聚體可包含由膚鍵連接 的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸單元組成的主鏈。膚核酸具有與互補(bǔ)核酸低聚體的較高結(jié)合親 和性和提高的特異性，因此，特別可有利于本文所述診斷和其它傳感應(yīng)用。
[0009] 在一些實(shí)施方案中，探針706具有與祀標(biāo)記712部分或完全互補(bǔ)的序列，例如尋求 的核酸序列。祀標(biāo)記712為用于檢測(cè)的分子，如W下更詳細(xì)描述。在一些實(shí)施方案中，探針 706為能夠結(jié)合到尋求檢測(cè)的祀核酸的至少一部分的單鏈寡核巧酸。在某些方法中，探針 706具有與祀序列不互補(bǔ)的區(qū)域，例如W調(diào)節(jié)鏈間雜交，或在分析期間作為無(wú)義或陰性對(duì) 照。探針706也可包含其它部分，例如縱向間隔基、雙鏈區(qū)域、單鏈區(qū)域、聚(T)連接體、和作 為剛性連接體和PEG間隔基的雙鏈體。在某些方法中，電極702可裝配有用于多種不同祀712 的多種不同探針706。
[0010] 探針706包括促進(jìn)探針706結(jié)合到電極702的連接體704。在某些方法中，連接體704 與探針706關(guān)聯(lián)，并結(jié)合到電極702。例如，連接體704可W為官能團(tuán)，例如硫醇、二硫醇、胺、 簇酸或氨基。例如，它可W為連接到多核巧酸探針的5'端的4-琉基苯甲酸。在某些方法中， 連接體704與電極702關(guān)聯(lián)，并結(jié)合到探針706。例如，電極702可包括胺、硅烷或硅氧烷官能 團(tuán)。在某些方法中，連接體704獨(dú)立于電極702和探針706。例如，連接體704可W為溶液中結(jié) 合到電極702和探針706二者的分子。
[0011] 在適合條件下，例如，在適合的雜交緩沖劑中，探針706可雜交到互補(bǔ)祀標(biāo)記712， W指示樣品中祀標(biāo)記712的存在。在某些方法中，樣品為來(lái)自生物宿主的生物樣品。例如，樣 品可w為組織、細(xì)胞、蛋白質(zhì)、流體、基因物質(zhì)、細(xì)菌物質(zhì)或病毒物質(zhì)、植物質(zhì)、動(dòng)物質(zhì)、培養(yǎng) 細(xì)胞或其它有機(jī)體或宿主。樣品可W為全有機(jī)體或其組織、細(xì)胞或組成部分亞組，可包括細(xì) 胞或非細(xì)胞生物物質(zhì)。流體和組織可包括但不限于血液、血漿、血清、腦脊液、淋己、眼淚、唾 液、血液、粘膜、淋己液、滑液、腦脊液、羊水、羊膜廝血、尿、陰道液、精液、眼淚、乳汁和組織 切片。樣品可包含核酸，例如，脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸和核糖 核酸的共聚物或其組合。在某些方法中，祀標(biāo)記712為已知對(duì)宿主、病原體、疾病或性狀獨(dú)特 的核酸序列，換針706提供勒1標(biāo)記712序列的互補(bǔ)序列，W允許檢測(cè)樣品中的宿主序列。
[0012] 在某些方面，本發(fā)明提供對(duì)樣品進(jìn)行處理步驟(例如，純化和提取)的系統(tǒng)、裝置和 方法?？稍诩?xì)胞、細(xì)菌或病毒內(nèi)馨合用于檢測(cè)的分析物或祀分子，例如核酸?？商幚順悠罚琖 分離、隔離或接近在樣品中包含的各種組分、組織、細(xì)胞、片斷和分子。處理步驟可包括但不 限于純化、均化、溶解和提取步驟。處理步驟可分離、隔離或接近在樣品中或來(lái)自樣品的祀 標(biāo)記，例如祀標(biāo)記712。
[0013] 在某些方法中，祀標(biāo)記712為DNA或RNA形式的基因物質(zhì)，從天然存在的原核生物 (例如，病原或非病原菌(例如，大腸埃希桿菌、沙口氏菌、梭菌、衣原體等））、真核生物（例 如，原生動(dòng)物、寄生蟲、真菌和酵母菌）、病毒(例如，瘤疹病毒、HIV、流感病毒、埃己病毒、乙 型肝炎病毒等）、植物、昆蟲和動(dòng)物(包括人)及組織培養(yǎng)中的細(xì)胞得到。來(lái)自運(yùn)些源的祀核 酸可例如發(fā)現(xiàn)于來(lái)自動(dòng)物(包括人)的體液的生物樣品。在某些方法中，樣品從生物宿主(例 如，患者)得到，且包括非人物質(zhì)或有機(jī)體，例如細(xì)菌、病毒、其它病原體。
[0014] 可任選在檢測(cè)前擴(kuò)增祀核酸分子，例如祀標(biāo)記712。祀核酸可W為雙鏈或單鏈形 式。在擴(kuò)增反應(yīng)開始時(shí)，可通過例如加熱、堿處理方法或通過酶促處理用變性劑處理雙鏈形 式，W使雙鏈成為單鏈形式或部分單鏈形式。
[0015] 一旦已處理樣品W暴露祀核酸，例如祀分子712,就可如本文所述檢驗(yàn)樣品溶液， W檢測(cè)探針706和祀分子712之間的雜交。例如，可應(yīng)用電化學(xué)檢測(cè)，如W下更詳細(xì)討論。如 果在樣品中不存在祀分子712,則本文所述系統(tǒng)、裝置和方法可檢測(cè)沒有祀分子存在。例如， 在診斷細(xì)菌病原體的情況下，例如沙眼衣原體(CT)，在樣品中存在祀分子，例如，來(lái)自沙眼 衣原體的RNA序列，將指示生物宿主(例如患者）中存在該細(xì)菌，在樣品中不存在祀分子指示 宿主未感染沙眼衣原體。同樣，其它標(biāo)記可用于其它病原體和疾病。
[0016] 參考圖1，系統(tǒng)700的探針706雜交到互補(bǔ)祀分子712。在某些方法中，通過互補(bǔ)堿基 配對(duì)雜交。在某些方法中，也可發(fā)生失配或不完全雜交。"失配"一般指在雜交期間兩種不同 核酸鏈(探針和祀)之間非互補(bǔ)核巧酸的配對(duì)。一般認(rèn)為互補(bǔ)配對(duì)為A-T、A-U和C-G。局部環(huán) 境條件，例如離子強(qiáng)度、溫度和pH，可影響堿基之間可能出現(xiàn)失配的程度，也可將此稱為雜 交的"特異性"或"嚴(yán)格性"。其它因素，例如核巧酸序列的長(zhǎng)度和探針類型，也可影響雜交的 特異性。例如，較長(zhǎng)核酸探針具有對(duì)于失配比較短核酸探針更高的容限。
[0017] 如圖中所示，通過電化學(xué)技術(shù)確定樣品中存在或不存在祀標(biāo)記712。運(yùn)些電化學(xué)技 術(shù)允許檢測(cè)極低含量的核酸分子，例如從生物宿主得到的祀RNA分子。電化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用更 詳細(xì)描述于美國(guó)專利7，361，470和7，741，03及PCT申請(qǐng)PCT/US12/024015，所述專利全文通 過引用結(jié)合到本文中。W下提供應(yīng)用于