一種布美諾肽的固相合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及多肽合成領(lǐng)域，特別涉及一種以長鏈脂肪酸做Linker進(jìn)行布美諾肽固 相合成的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 布美諾肽，英文名稱為Bremelanotide，又稱布雷默浪丹，PT141，由7個(gè)氨基酸組 成，與促黑素細(xì)胞激素具有相同的核心序列，后者的受體在食欲及性欲喚起中起重要作
用〇 甘月太 ΓΦ：斗ιΛ/^_Μ? ~Γ Λ-…? . _Γ\υ 社士如下，
[0003]
[0004] 性功能障礙分為男性性功能障礙及女性性功能障礙，目前用于治療男性性功能障 礙的藥物多數(shù)為磷酸二酯酶5(PDE-5)抑制劑，例如西替那非，他達(dá)拉非，伐地那非。此類藥 物的作用機(jī)制為維持或者升高體內(nèi)環(huán)腺苷酸(cAMP)的濃度，增加動(dòng)脈血液流入，降低靜脈 血液流出，從而導(dǎo)致陰莖血流增加，但此類藥物對(duì)女性性功能障礙不具有顯著療效。
[0005] 女性性反應(yīng)周期是復(fù)雜的并且取決于生理，心理因素，用于女性性功能障礙的藥 物必須針對(duì)并且必須依賴中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而動(dòng)物和人類的研究都已經(jīng)表明布美諾肽具有明 顯的與局部生殖器血管充血無關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)效應(yīng)。與其它多肽類藥物相似，布美諾肽 劑量少，療效高，不會(huì)引發(fā)蓄積中毒，因此，在治療女性性功能障礙上有廣闊的市場前景。
[0006] 目前，布美諾肽的合成方法主要為固相合成法。專利CN200610086841.4采用逐步 合成的方法，肽樹脂合成結(jié)束后，選擇性脫除Asp及Lys的保護(hù)基，之后在樹脂上成環(huán)，最后 以HF裂解，因?yàn)镠F的劇烈腐蝕性而導(dǎo)致該方法無法大規(guī)模使用，其實(shí)施例公布的精肽收率 為30~35%;專利CN200710048824.6同樣采用選擇性脫保護(hù)的方法，但其所選擇的的脫保 護(hù)方法在脫除Asp及Lys側(cè)鏈保護(hù)基的同時(shí)也會(huì)脫除His的保護(hù)基，其實(shí)施例公布的粗肽收 率為80%;專利0呢00910131598.7布雷默浪丹的固相合成方法中將對(duì)羥基苯甲酸連接在 1^111^1]11(16 1^8；[11之后，采用普通氨基酸原料逐步合成，合成結(jié)束后以1?4裂解，在液相條 件下成環(huán)，但是該方法在進(jìn)行液相成環(huán)時(shí)容易發(fā)生分子間偶聯(lián)，產(chǎn)生二聚體，三聚體等多聚 物，嚴(yán)重降低合成收率，此外，該專利在樹脂與肽鏈間連接的對(duì)羥基苯甲酸分子較小，無法 提供足夠大的空間改善固相成環(huán)反應(yīng)。
[0007] 布美諾肽是由7個(gè)氨基酸組成的環(huán)肽，其合成的技術(shù)難點(diǎn)在于成環(huán)。目前布美諾肽 的合成技術(shù)根據(jù)成環(huán)方法可分為兩類，一類是液相中成環(huán)，一類是樹脂上成環(huán)。在液相中成 環(huán)容易產(chǎn)生大量分子間偶聯(lián)產(chǎn)物，固相成環(huán)方法又因空間位阻太大而導(dǎo)致成環(huán)困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為解決布美諾肽合成的技術(shù)難點(diǎn)，本發(fā)明提供一種以長鏈脂肪酸做Linker進(jìn)行布 美諾肽固相合成的方法。具體為以Rink Amide Resin為固相載體，以H0-(CH2)n-C00H作為連 接固相載體與目標(biāo)肽的Linker，其中，羧基端通過酰胺鍵與固相載體相連，羥基端通過酯鍵 與目標(biāo)肽相連。目標(biāo)肽合成結(jié)束后，選擇性脫除Asp及Lys的側(cè)鏈保護(hù)基，在樹脂上成環(huán)，環(huán) 化結(jié)束后裂解，得布美諾肽_(CH 2 )n-NH2，堿性條件下斷開酯鍵，得布美諾肽粗肽，經(jīng)過純化， 凍干后得布美諾肽精肽。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0010] 布美諾肽的固相合成方法，包括如下步驟：
[0011] (a):Rink Amide Resin與長鏈脂肪羥基酸H〇-(CH2)n-⑶0H偶聯(lián)合成恥-⑴出）^ CONH-Rink Amide Resin；
[0012] (b):依照布美諾肽序列，在偶聯(lián)劑存在條件下，依次偶聯(lián)Fmoc-Lys(Mtt)-〇H， Fmoc-Trp(Boc)-〇H，F(xiàn)moc-Arg(pbf)-〇H，F(xiàn)moc-D-Phe-〇H，F(xiàn)moc-His(Boc)-〇H，F(xiàn)moc-Asp(〇- 2-卩1^?〇-0!^111〇(3-祖6-0!^111〇(3，16-0!1，偶聯(lián)完成后脫除?111〇(3保護(hù)基，以乙酸酐/吡啶進(jìn) 行乙?；?，得 AC-Nle-Asp(〇-2-Phipr)-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Mtt)-〇-(CH 2)n-C0NH-Rink Amide Resin；
[0013] (〇):采用了？4/001溶液，選擇性脫除1^8側(cè)鏈保護(hù)基批丨^叩側(cè)鏈保護(hù)基0-2-Phipr，得 AC-Nle-Asp-His (Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys-〇-(CH2)n-CONH_Rink Amide Resin；
[0014] (d):在偶聯(lián)劑存在條件下進(jìn)行樹脂上環(huán)化，得:AC-Nle-HAsp-HisWcK^-D-Phe-ArgCpbfO-Trpaoc^-Lysilcycie-OHQ^n-CONH-Rink Amide Resin;
[0015] (e):在裂解劑存在條件下，將肽樹脂裂解及側(cè)鏈脫保護(hù)4#:AC-Nle-[A Sp-HiS-D-Phe-Arg-Trp-Lys ] cycie-0- (CH2) n-C0NH2;
[0016] (f):以乙腈/水將AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]cyci e-0-(CH2)n-C0NH2溶 解，在堿性條件下酯鍵水解，溶液調(diào)酸后得布美諾肽粗肽；
[0017] (g):布美諾肽粗肽經(jīng)過純化，凍干，得布美諾肽精肽。
[0018] 其中步驟(a)中，所述長鏈脂肪羥基酸H0-(CH2)n-C00H為8-羥基辛酸或16-羥基十 六酸，η等于7或15;RinkAmide Resin的替代度為0.4~0.6mmol/g;
[0019] 步驟（b)和步驟（d)中縮合劑組合為DMAP/DIC/H0BT，DMAP/DIC/H0AT，DIC/H0BT， DIC/H0AT，HBTU/H0BT/DI PEA，HATU/H0AT/DI PEA 中的一種；
[0020] 步驟(C)中TFA/DCM溶液中TFA所占體積比為3~5% ;
[0021]步驟(e)中，裂解試劑為加入體積比1-5%清除劑的TFA溶液，清除劑為苯甲醚、苯 甲硫醚、乙二硫醇、巰基乙醇、苯酚、水、三異丙基硅烷中的一種或幾種；
[0022]步驟(f)中，乙腈/水體系中，乙腈所占的比例為5~15 %，堿性條件中堿為氫氧化 鈉，氫氧化鉀，氫氧化鋰中的一種。
[0023] 優(yōu)選的，一種布美諾肽的固相合成方法包括如下步驟：
[0024] (a)以 0.52mmol/g 的 Rink Amide Resin 為固相載體，在 DIC/H0BT 存在下，與 H0- (CH2)7-C00H偶聯(lián)，合成HO-(CH2) 7-CONH-RinkAmide Resin;
[0025] (b):依照布美諾肽序列，在DMAP/DIC/HOBT存在條件下，偶聯(lián)Fmoc-Lys(Mtt)-〇H， 在010/!10131'存在條件下，依次偶聯(lián)?1]1〇(3-1'印(13〇(3)-0!1，？1]1〇(3-4坪(口&;〇-0!1，？1]1〇(3-0-?]16-0!1， Fmoc-His(Boc)-〇H，F(xiàn)moc-Asp(〇-2-Phipr)-〇H，F(xiàn)moc-Nle-〇H，F(xiàn)moc-Nle-〇H，偶聯(lián)完成后脫 除Fmoc保護(hù)基，以乙酸酐/吡啶進(jìn)行乙?；?，得AC-Nle-Asp(〇-2-Phipr)-His(Boc)-D_Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Mtt)-〇-(CH2)7 -CONH_Rink Amide Resin;
[0026] (c):采用5%體積比的TFA/DCM溶液，選擇性脫除Lys側(cè)鏈保護(hù)基Mtt，Asp側(cè)鏈保護(hù) 基O-2-Phipr，得AC-Nle-Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys-〇-(CH2)7 -CONH-Rink Amide Resin；
[0027] (d):在HBTU/HOBT/DIEA存在條件下進(jìn)行樹脂上環(huán)化，得:AC-N1 e-[Asp-His(Boc)-D-Phe~Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys]Cyde-〇-(CH2)7-CONH-Rink Amide Resin ；
[0028] (e):在體積比為TFA: TIS: H20 = 95 : 2.5: 2.5的裂解劑條件下，將肽樹脂裂解及側(cè) 鏈脫保護(hù)，得:AC-N1 e- [ Asp-Hi s-D-Phe-Arg-Trp-Ly s ] cycie-0- (CH2) 7-C0NH2;
[0029] (f):以體積比為5:95的乙腈/水將AC-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys] cycie-〇-(CH2) 7-⑶NH2溶解，以2mo 1/L的NaOH/水溶液調(diào)pH值到12，0~5 °C反應(yīng)0 · 5h，30 °C繼續(xù)反應(yīng) lh，反應(yīng)過程中維持溶液pH在12~14之間，1.5h后取樣以HP-LC檢測，酯鍵斷裂完全，停止 反應(yīng)，離心除去所析出的白色物質(zhì)，上清液以2mol/L的HC1水溶液調(diào)節(jié)pH至6~7，置于-20°C 冰箱中保存；
[0030] (g):將布美諾肽粗肽水溶液以反向制備色譜純化，凍干，得布美諾肽精肽。
[0031] 更優(yōu)選的，一種布美諾肽的固相合成方法包括如下步驟：
[0032] (a)以 0.52mmol/g 的 Rink Amide Resin 為固相載體，在 DIC/H0BT 存在下，與 H0-(CH2) 15-C00H偶聯(lián)，合成H0-( CH2) i5-C0NH-RinkAmide Res in，
[0033] (b):依照布美諾肽序列，在DMAP/DIC/HOBT存在條件下，偶聯(lián)Fmoc-Lys(Mtt)-〇H， 在010/!10131'存在條件下，依次偶聯(lián)?1]1〇(3-1'印(13〇(3)-0!1，？1]1〇(3-4坪(口&;〇-0!1，？1]1〇(3-0-?]16-0!1， Fmoc-His(Boc)-〇H，F(xiàn)moc-Asp(〇-2-Phipr)-〇H，F(xiàn)moc-Nle-〇H，F(xiàn)moc-Nle-〇H，偶聯(lián)完成后脫 除