一種橙皮苷酶的生產(chǎn)方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種橙皮苷酶的生產(chǎn)方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 橙皮苷酶是水解橙皮苷關(guān)鍵酶，具有很高的應(yīng)用價值。利用橙皮苷酶水解橙皮苷 可以得到橙皮素單糖苷、橙皮素、鼠李糖和葡萄糖。此外將橙皮苷酶添加到桔瓣罐頭中，水 解其中的橙皮苷，可以防止柑桔罐頭產(chǎn)生白色沉淀。
[0003] 橙皮苷酶可由多種微生物產(chǎn)生，如青霉菌、米曲霉、黑曲霉和擬桿菌屬等。目前國 內(nèi)關(guān)于產(chǎn)橙皮苷酶菌株的研究還比較少，已有報道的產(chǎn)橙皮苷酶的菌株多為霉菌。
[0004] 在現(xiàn)有采用霉菌生產(chǎn)橙皮苷酶的方法中，由于生產(chǎn)的橙皮苷酶的酶活低、熱穩(wěn)定 性差導(dǎo)致生產(chǎn)橙皮苷酶成本比較高，很難達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。而橙皮苷酶的酶活的高 低與熱穩(wěn)定性的優(yōu)劣與菌株的選擇、培養(yǎng)方法和發(fā)酵條件等有關(guān)，進(jìn)而，選擇具有優(yōu)勢的菌 株，以及設(shè)計合適的培養(yǎng)方法和發(fā)酵條件是生產(chǎn)酶活高、熱穩(wěn)定性好的橙皮苷酶的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供一種反應(yīng)條件溫和、選擇性好、工藝簡單優(yōu)化的橙皮苷酶的 生產(chǎn)方法，解決現(xiàn)有橙皮苷酶的酶活低、酶熱穩(wěn)定性差的問題。
[0006] 此外，本發(fā)明還涉及橙皮苷酶的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0008] -種橙皮苷酶的生產(chǎn)方法，包括以下步驟：
[0009 ] 1 )、將黑曲霉在培養(yǎng)基中進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)形成黑曲霉孢子；
[0010] 2)、黑曲霉孢子在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶生產(chǎn)橙皮苷酶；
[0011] 3)、分離提取獲得酶液；
[0012] 所述黑曲霉保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏名稱為 KH005,其保藏號為:CGMCC12101。
[0013]現(xiàn)有的橙皮苷酶的在生產(chǎn)方法通產(chǎn)是采用微生物（主要是指霉菌和真菌）降解橙 皮苷獲得，雖然能生產(chǎn)橙皮苷酶的菌株有很多，但是現(xiàn)有發(fā)現(xiàn)的菌株產(chǎn)橙皮苷酶的能力弱， 即生產(chǎn)的橙皮苷酶的酶活低，且橙皮苷酶的熱穩(wěn)定性差，影響橙皮苷酶的酶活和熱穩(wěn)定性 的因素除了菌株的選擇外，還與發(fā)酵反應(yīng)條件有關(guān)。
[0014] 本申請人通過多次試驗，發(fā)現(xiàn)了一株新的黑曲霉菌株KH005,將其通過本發(fā)明所述 工藝步驟生產(chǎn)的橙皮苷酶的效率高，生產(chǎn)的橙皮苷酶的酶活高、熱穩(wěn)定性好;橙皮苷酶的酶 活的測定過程如下：
[0015] 試管中加入5ml pH4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液、4.5ml濃度為0.2%的橙皮苷底物溶 液，在45 °C水浴下保溫5min，然后加入，0.5ml上述粗酶液，充分搖勻，準(zhǔn)確計時，45 °C反應(yīng) 20min，再迅速移入沸水浴中滅活lOmin，采用高效液相色譜法測得剩余底物量，得出底物減 少量，從而測出酶活。
[0016] 計算公式如下：
[0017] 粗酶液的酶活力〇]/!111) = (13-&)/(20\0.5);其中，&化8)為酶解后剩余底物含量； b(yg)為反應(yīng)前的底物含量。
[0018] 測定結(jié)果表明該粗酶液橙皮苷酶活性為2349-2647U。
[0019] 對于酶活的計算方式主要包括兩種:一種是按照液體體積計算U/ml;另一種是按 照所投原料的質(zhì)量計算U/g，本發(fā)明所述的酶活經(jīng)過優(yōu)化后3-4天酶活(按照液體體積計算 U/ml)便可以達(dá)到2000U以上，如果按照所投原料的質(zhì)量計算，我們的菌株酶活可以達(dá)到 80000U/g 以上。
[0020]橙皮苷酶的酶活定義:在45°C、pH4.5的條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化1微克橙皮苷底物所需 的酶量為一個酶活力單位(U)。
[0021] 酶活的定義不同文章或者專利有一定的差異，但是我們酶活的定義采用的是目前 比較公認(rèn)的一種定義?？梢詤⒁娢墨I(xiàn)（申麗靜，汪釗.橙皮苷酶的制備及其催化性質(zhì)的研究 [D].浙江工業(yè)大學(xué)，2006:63;孟娜，魏勝華，鄭長龍.黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)橙皮苷酶的工藝優(yōu)化 [J]·生物技術(shù)，2011,21(2): 77-80)。
[0022] 并且，對制備的粗酶液中的橙皮苷酶的熱穩(wěn)定性進(jìn)行測定：
[0023] 通過將橙皮苷酶置于一定溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，每隔一段時間測量橙皮苷酶的酶活， 以最初的橙皮苷酶的酶活進(jìn)行比較來判斷橙皮苷酶的熱穩(wěn)定性，申請人通過實驗證明：通 過本發(fā)明所述的黑曲霉KH005生產(chǎn)的橙皮苷酶的熱穩(wěn)定性好:在50-55°C條件下反應(yīng)72h后， 酶活可以保存50 %左右;在60-65 °C條件下反應(yīng)24h酶活依然可以保存50 %左右，即在50-55 °C條件下，酶的半衰期為72h，在60-65Γ條件下半衰期為24h，而現(xiàn)有的菌株所產(chǎn)酶的熱穩(wěn) 定性較差，當(dāng)在大于45°C的水浴中處理30min左右，酶活便出現(xiàn)了明顯的下降，超過2h酶基 本失活。
[0024] 本發(fā)明中涉及保藏的黑曲霉的保藏信息如下:保藏單位：中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心;地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究 所；保藏日期：2016年1月25日；保藏編號：CGMCC12101，保藏名稱為KH005 ;分類命名： Aspergillus niger〇
[0025] 黑曲霉菌株KH005的獲得：
[0026] 黑曲霉是以枳實(通過市場購買獲得)為原料，在培養(yǎng)基中經(jīng)過初篩選挑選出產(chǎn)橙 皮苷酶能力大的菌株，將初篩選出的菌株在培養(yǎng)基中經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接篩選獲得。
[0027] 黑曲霉KH005的篩選過程：
[0028] 1)、培養(yǎng)基的制備：將2.0g硝酸鈉、0.05g氯化鉀、1.0g磷酸二氫鉀、18.0g橙皮苷、 20. g瓊脂溶解與1L蒸餾水中，并用1M的鹽酸調(diào)pH為6.0-6.5，分裝三角瓶，121°C滅菌15min， 待培養(yǎng)基冷至50-55 °C時，倒平板，冷卻后備用。
[0029] 2)、菌株的初篩:無菌條件下取20克枳實于裝有200mL無菌水三角瓶中，置搖床上 室溫振蕩30分鐘。取菌液按10倍的梯度稀釋到10'取各稀釋度菌液lmL放入無菌平皿中，倒 入滅菌后冷卻至50°C的培養(yǎng)基，混勻，待凝固后放入30 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天，觀察菌落周圍透 明圈的大小進(jìn)行初篩，挑取有透明圈的菌株保經(jīng)進(jìn)一步純化后保存到斜面培養(yǎng)基;然后將 純化后的菌株接種到平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天，測量透明圈的直徑，結(jié)果如表1所示。因為橙皮 苷酶分解橙皮苷產(chǎn)生在菌落周圍形成透明圈，所以通過透明圈的大小可以初步判斷菌株產(chǎn) 橙皮苷酶能力的大小。挑選菌落周圍有透明圈的單菌落保存。初篩得到的菌株經(jīng)形態(tài)觀察 發(fā)現(xiàn)均為霉菌。
[0030] 表1初篩得到菌株的菌落形態(tài)及透明圈直徑
[0031]
[0032]
[0033] 3)、菌株的復(fù)篩：
[0034] 將初篩的菌株經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接后發(fā)現(xiàn)，大部數(shù)菌株菌落生長逐漸變得緩慢，形成的 透明圈也越來越小。經(jīng)過多代篩選，最終獲得了一株生長迅速、色素少且產(chǎn)橙皮苷酶能力穩(wěn) 定的菌株KH005,根據(jù)形態(tài)初步鑒定為霉菌。
[0035] KH005菌株的鑒定：
[0036] 1)、DNA 提?。?br>[0037] 收集菌體，溶于5mL提取緩沖液（lOOmMTris · Cl，100mM Na2EDTA，200mM NaCl，2% CTAB，pH8.0)中，37°C振蕩45min。加入0.75mL 20%SDS，65°C水浴lh<a2,000rpm，離心 lOmin，收集上清。上清用等體積的酚:氯仿:異戊醇（25:24:1)抽提2次，加入終濃度0.3M的 NaAC(pH5.2)及2倍體積的無水乙醇，室溫沉淀1 h。4 °C，12，OOOrpm，離心20min，收集沉淀，用 70%乙醇漂洗2次，晾干后溶于50yL TE( 10mmTris-Hcl，lmmNa2EDTA)中，即得總DNA。
[0038] 2)、擴(kuò)增 ITS序列：
[0039] 以上述總DNA為模板，真菌通用引物ITS1(SEQ ID No.2:TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和 ITS4(SEQ ID No. 3:TCCTCCGCTTATTGATATGC)分別為正向引物和反向引物擴(kuò)增ITS序列。擴(kuò) 增反應(yīng)體系為50yL: 10 X Buf f er 5yL，dNTP lyL，Taq酶0.5yL( 2U)，正反向引物各ly