一種誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的培養(yǎng)基及其誘導(dǎo)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于干細(xì)胞領(lǐng)域，具體涉及一種誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的培養(yǎng)基及其誘導(dǎo)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]干細(xì)胞作為再生醫(yī)學(xué)和組織工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，具有自我更新與多向分化潛能，干細(xì)胞具有自我更新與多向分化潛能，有研究證明，胚胎干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、人臍帶血干細(xì)胞等可被定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，成為神經(jīng)細(xì)胞新的來源，因此干細(xì)胞誘導(dǎo)分化神經(jīng)樣細(xì)胞成為研究熱點(diǎn)。
干細(xì)胞可分化為各種神經(jīng)細(xì)胞包括神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等，通過細(xì)胞移植來達(dá)到替代受損神經(jīng)細(xì)胞、改善神經(jīng)功能的作用。適宜治療的疾病有缺氧缺血性腦損傷(如新生兒缺氧缺血性腦病、腦梗死)、退行性疾病(如帕金森氏癥)、脫髓鞘病變(如多發(fā)性硬化癥)、兒童外傷性腦損傷以及遺傳代謝性疾病。
[0003]基于以上兩個(gè)方面原因，我們需要一個(gè)高效、快速和穩(wěn)定的神經(jīng)細(xì)胞分化平臺(tái)作為
以上研究和應(yīng)用的載體。但胚胎干細(xì)胞存在培養(yǎng)擴(kuò)增難度大，成瘤性強(qiáng)，并存在倫理問題等;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源受限，擴(kuò)增難度大，而且對(duì)供者存在一定的損傷。因此誘導(dǎo)后的神經(jīng)樣細(xì)胞應(yīng)用受限，無法滿足大量需求，比如用于替代治療受損神經(jīng)細(xì)胞，以及進(jìn)行細(xì)胞藥物的篩選。目前國內(nèi)外集中于以間充質(zhì)干細(xì)胞為來源誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分化為主，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是從臍帶華通膠質(zhì)中分離出的新型干細(xì)胞，其再生能力強(qiáng)，來源豐富，表面抗原性很弱，不被受體的免疫系統(tǒng)所識(shí)別，移植物抗宿主病極少見，并且具有向神經(jīng)細(xì)胞等方向分化的功能，可作為移植治療受損神經(jīng)細(xì)胞的種子細(xì)胞。采用策略主要是多種生長因子來聯(lián)合誘導(dǎo)，從而獲得成熟的定向分化細(xì)胞。
[0004]然而怎樣才能將其高效誘導(dǎo)分化成神經(jīng)樣細(xì)胞，用于細(xì)胞生物治療其中仍存在許多問題亟需解決:I)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，受干擾因素非常多，首先是誘導(dǎo)方案不確定;2)采用的誘導(dǎo)因子不規(guī)范，不能保證干細(xì)沿預(yù)期方向分化、增殖;3)多采用β_巰基乙醇，其毒性令人望而卻步，影響后續(xù)臨床應(yīng)用;4)誘導(dǎo)分化后的神經(jīng)樣樣細(xì)胞巢蛋白分泌效率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述存在的問題，本發(fā)明建立了一種規(guī)范的、新穎的誘導(dǎo)方法，可高效、 穩(wěn)定地將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)為神經(jīng)樣細(xì)胞。
[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的培養(yǎng)基;本發(fā)明的另一目的在于提供一種誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的方法。
[0007]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有以下組分:
活化素A2?6nmol/L
表皮生長因子20?30yg/L
β-神經(jīng)生長因子80?120yg/L
尼克酰胺5?15mmol/L
UItraCULTURE培養(yǎng)基余量。
[0008]進(jìn)一步的，上述培養(yǎng)基含有以下組分:
活化素A4nmol/L
表皮生長因子25yg/L
β-神經(jīng)生長因子100yg/L
尼克酰胺10mmol/L
UItraCULTURE培養(yǎng)基余量。
[0009]—種誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的方法，包括以下步驟:通過組織塊方法從臍帶中分離獲得間充質(zhì)干細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀鑒定其表面標(biāo)記。將第三代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞用上述所述的培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，在UltraCULTURE培養(yǎng)基中加入4 nmol/L活化素A，25yg/L表皮生長因子，100yg/L β-神經(jīng)生長因子，10 mmol/L尼克酰胺，培養(yǎng)至14d。以UI tra⑶LTURE培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為陰性對(duì)照。
[0010]進(jìn)一步的，上述誘導(dǎo)培養(yǎng)14天后即可獲得神經(jīng)樣細(xì)胞。
[0011]本發(fā)明的有益效果是:
1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中所含細(xì)胞因子，均屬于無毒害物質(zhì)，更安全；
2)本發(fā)明誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的方法，7天即可發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)細(xì)胞成神經(jīng)纖維樣，14天可獲得成熟的神經(jīng)樣細(xì)胞，與現(xiàn)有技術(shù)誘導(dǎo)時(shí)間不穩(wěn)定，誘導(dǎo)細(xì)胞不成熟，巢蛋白分泌量過低相比，大大增加了誘導(dǎo)效率；
3)人臍帶組織易于獲得;分化后神經(jīng)樣細(xì)胞的巢蛋白表達(dá)更高，可為神經(jīng)缺失相關(guān)疾病細(xì)胞治療提供理想的種子細(xì)胞，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0012]圖1流式細(xì)胞儀檢測臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面免疫表型，陰性表達(dá)CD14-FITC、CD34-PE、HLA-DR-APC，陽性表達(dá)CD44-FITC、CD90-PE、CD 105-APC，符合干細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)；
圖2臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的過程中形態(tài)變化。(A)第三代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞呈現(xiàn)梭型形態(tài)(100X) ; (B)分化培養(yǎng)的7d后，干細(xì)胞形態(tài)開始呈現(xiàn)神經(jīng)纖維樣(100X); (C)分化培養(yǎng)14d后臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)變?yōu)榈湫偷纳窠?jīng)樣細(xì)胞(100X);
圖3干細(xì)胞誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)7d以及誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后的細(xì)胞流式檢測巢蛋白表達(dá)情況，在誘導(dǎo)培養(yǎng)的過程中，隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長，巢蛋白表達(dá)量逐漸增加。
【具體實(shí)施方式】
[0013]—種誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于:該培養(yǎng)基含有以下組分:
活化素A2?6nmol/L
表皮生長因子20?30yg/L
β-神經(jīng)生長因子80?120yg/L
尼克酰胺5?15mmol/L
UItraCULTURE培養(yǎng)基余量。
[0014]優(yōu)選的，上述培養(yǎng)基含有以下組分:
活化素A4nmol/L
表皮生長因子25yg/L
β-神經(jīng)生長因子100yg/L
尼克酰胺10mmol/L
UItraCULTURE培養(yǎng)基余量。
[0015]—種誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的方法，包括以下步驟:通過組織塊方法從臍帶中分離獲得間充質(zhì)干細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀鑒定其表面標(biāo)記。將第三代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞用上述所述的培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，在UltraCULTURE培養(yǎng)基中加入4 nmol/L活化素A，25yg/L表皮生長因子，100yg/L β-神經(jīng)生長因子，10 mmol/L尼克酰胺，培養(yǎng)至14d。以UI tra⑶LTURE培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為陰性對(duì)照。
[0016]將通過組織塊方法從臍帶中分離獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞，流式細(xì)胞儀鑒定其表面標(biāo)記，確定其屬于間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0017]上述誘導(dǎo)培養(yǎng)14天后即可獲得成熟的神經(jīng)樣細(xì)胞。
[0018]上述誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中每三天換一次液。
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
[0020]實(shí)施例1:一種誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的培養(yǎng)基含有以下組成:
活化素A4nmol/L
表皮生長因子25yg/L
β-神經(jīng)生長因子100yg/L
尼克酰胺10mmol/L
UItraCULTURE培養(yǎng)基余量。
[0021]上述培養(yǎng)基的制備:先將活化素A、表皮生長因子、β-神經(jīng)生長因子、尼克酰胺、加入到UI traCU