一種采用酵母菌評價油田鉆井液生物毒性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及鉆井液生物毒性的評價方法，具體涉及一種采用酵母菌評價油田鉆井 液生物毒性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 油田鉆井液是油井鉆探過程中在鉆孔內(nèi)使用的循環(huán)沖洗介質(zhì)，主要由液相、固相 和化學(xué)處理劑組成。液相可以是水(淡水、鹽水)、油（原油、柴油）或乳狀液(混油乳化液、反 相乳化液）等；固相包括有用固相(膨潤土、加重材料）和無用固相(巖石）等；化學(xué)處理劑包 括無機、有機及高分子化合物等。
[0003] 隨著石油工業(yè)的持續(xù)發(fā)展，油田鉆井液的成分越來越復(fù)雜，其生物毒性對環(huán)境的 影響亦越來越明顯。因此，以生物毒性為評價指標(biāo)，強化油田鉆井液源頭控制措施，避免后 續(xù)環(huán)境污染，已成為當(dāng)前迫切需要解決的問題。
[0004] 目前，國內(nèi)外尚無統(tǒng)一的油田鉆井液生物毒性檢測方法及分級標(biāo)準(zhǔn)。美國石油學(xué) 會推薦執(zhí)行的《鉆井液生物毒性測定標(biāo)準(zhǔn)》采用巴西擬糠蝦作為實驗生物，由于該實驗生物 物種在我國無分布且脆弱易死亡，我國學(xué)者致力于尋找新的實驗生物。
[0005] 中國國家標(biāo)準(zhǔn)《海洋石油勘探開發(fā)污染物生物毒性檢驗方法》（GB/ T18420. 2-2001)提到以蝦齡小于10d的小仔蝦或剛孵化的鹵蟲幼體作為實驗生物，但該方 法應(yīng)用于油田鉆井液生物毒性評價存在以下問題：（1)實驗物種來源不便，挑選條件不易 掌握，蝦齡要求苛刻，要求技術(shù)人員在專業(yè)實驗室進(jìn)行操作實驗，不便推廣應(yīng)用；（2)耗時， 每次實驗需96h以上且成本高；（3)操作過程復(fù)雜，實驗技術(shù)不易掌握，不能現(xiàn)場應(yīng)用。
[0006] 中國石油天然氣集團(tuán)公司企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《油田化學(xué)劑、鉆井液生物毒性分級及檢測方 法-發(fā)光細(xì)菌法》（Q/SY111-2007)是根據(jù)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光度與存活菌體數(shù)量成線性正相關(guān)的 特性，通過計算油田鉆井液對發(fā)光細(xì)菌的致死率來得出油田鉆井液的生物毒性水平，但多 數(shù)油田鉆井液所呈現(xiàn)的黑褐色在發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光波段有干擾，需要對各個樣品逐一進(jìn)行校 正后才能使用。
[0007] CN102031280A公開了一種利用海洋微藻評價油田鉆井液生物毒性的方法，該方法 要求使用天然海水對鉆井液樣品進(jìn)行處理，在測試過程中要求將油田鉆井液與海洋微藻混 合7~8h后才能得到生物毒性級別。該法由于測試材料受限、評價周期較長等特點，不適 用于快速評價油田鉆井液的生物毒性。
[0008] 綜上，在油田鉆探開發(fā)和生產(chǎn)過程中，亟需尋找一種能夠作為生物毒性評價的實 驗生物，使其能在油田鉆井液作用下，快速、有效及準(zhǔn)確的測得油田鉆井液的生物毒性，從 而建立起油田鉆井液生物毒性快速評價方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種采用酵母菌評價油田鉆井液生物毒性的方 法。本發(fā)明采用同步培養(yǎng)得到的形態(tài)均一的酵母菌作為實驗生物，可以在較短的反應(yīng)時間 內(nèi)靈敏高效、穩(wěn)定準(zhǔn)確的評價油田鉆井液的生物毒性，能夠滿足油田開發(fā)及生產(chǎn)中對快速 評價油田鉆井液生物毒性的需求。
[0010] 本發(fā)明采用酵母菌評價油田鉆井液生物毒性的方法，包括如下內(nèi)容： (1) 將酵母菌進(jìn)行活化并培養(yǎng)至穩(wěn)定期，得到的酵母菌培養(yǎng)液進(jìn)行離心； (2) 將上述離心后酵母菌體重懸后進(jìn)行不連續(xù)密度梯度離心，收集最上層包含幼齡酵 母菌或孢子的不連續(xù)密度梯度溶液，進(jìn)行同步培養(yǎng)； (3) 直接采用上述同步培養(yǎng)后得到的酵母菌作為評價菌種，或?qū)⒔湍妇瞥蓛龈煞蹌?使用； (4) 使用標(biāo)準(zhǔn)毒性物質(zhì)對酵母菌的生物毒性敏感性進(jìn)行校正，同時確定油田鉆井液對 酵母菌的生物毒性分級指標(biāo)； (5) 將酵母菌稀釋成一定菌體濃度的酵母菌懸液，并按濃度梯度制備油田鉆井液測試 樣品； (6) 將酵母菌懸液與油田鉆井液測試樣品接觸一定時間，通過染色法檢測各濃度油田 鉆井液測試樣品對酵母菌的致死率； (7) 計算油田鉆井液測試樣品對酵母菌的半數(shù)有效濃度（EC5。)，根據(jù)生物毒性分級指標(biāo) 確定油田鉆井液生物毒性等級。
[0011] 本發(fā)明方法中，所述的酵母菌選自釀酒酵母ce/wisiae)、葡萄 汁酵母i/Kari/a?)、漢遜酵母（/fease/wia)、球擬酵母（Tbri/io/wis)、假絲酵 母)、畢赤氏酵母（/VcAia)、紅酵母)、棉病針抱酵母(Afevas tejOara 或白地霉（feoiricA· cawi/ii/·)等，優(yōu)選釀酒酵母 cerevisiae)。
[0012] 本發(fā)明方法中，酵母菌的活化和培養(yǎng)采用本領(lǐng)技術(shù)人員熟知的方式。具體可以采 用以下方式：首先制備酵母菌種子液，然后按照10%接種量（v/V)將酵母菌種子液接種于新 鮮培養(yǎng)基進(jìn)行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25~35°C，搖床轉(zhuǎn)速100~150rpm，培養(yǎng)至穩(wěn)定期結(jié)束。 將上述酵母菌培養(yǎng)液在500~1000g離心力下離心并收集菌體。
[0013] 本發(fā)明方法中，制備不連續(xù)密度梯度離心的介質(zhì)可以為甘油、1，3_丙二醇、蔗糖、 乳糖、海藻糖、脫脂乳中的一種或幾種，優(yōu)選為海藻糖。選擇海藻糖作為離心介質(zhì)時，不連續(xù) 密度梯度溶液的制備方法為：在離心瓶中自下而上逐層鋪加濃度遞減的海藻糖水溶液，海 藻糖水溶液的質(zhì)量濃度為5%~70%，每層濃度逐級減少5%~30%。本發(fā)明可以鋪加3-5層， 優(yōu)選3層海藻糖水溶液，每層體積相同或不同，優(yōu)選最上層的海藻糖水溶液體積是其他層 的1. 5~3倍，以此制成海藻糖不連續(xù)密度梯度溶液。待離心酵母菌液的制備：取步驟（1) 收集的酵母菌體，然后用少量去離子水重新懸浮，將重懸后的酵母菌液鋪在制備好的海藻 糖不連續(xù)密度梯度溶液頂層，在50~100g離心力下離心5~10min，收集最上層不連續(xù)密 度梯度溶液，將其中包含的幼齡酵母菌或孢子進(jìn)行同步培養(yǎng)。同步培養(yǎng)溫度為25~35°C， 搖床轉(zhuǎn)速為100~150rpm。在同步培養(yǎng)時，可以加入5~30g/L的糖蜜，有助于酵母菌的活 性穩(wěn)定并提高其耐受能力。
[0014] 本發(fā)明方法中，進(jìn)行生物毒性評價用的酵母菌懸液可以采用同步培養(yǎng)酵母菌液直 接稀釋得到，也可以由酵母菌凍干粉劑復(fù)溶得到。由于油田鉆井液經(jīng)常需要在現(xiàn)場評價，因 此最好制備成酵母菌凍干粉劑。將同步培養(yǎng)酵母菌液制成凍干粉劑，具體過程為：將酵母 菌同步培養(yǎng)液在500~lOOOg離心力下離心并收集菌體，用20 wt%~50 wt%的冷凍干燥 保護(hù)劑水溶液將收集到的菌體重新混懸，再分裝于安剖管中進(jìn)行冷凍干燥，先在4°C下維持 6~8h、再在-20°C冰箱中維持6~8h、最后在-80°C維持24~48h ;冷凍干燥時控制凍干 機溫度-50~_80°C、真空度1~10pa、冷凍干燥時間24~48h，直至樣品表面出現(xiàn)裂痕，與 凍干管內(nèi)壁有脫落現(xiàn)象。本發(fā)明中，冷凍干燥保護(hù)劑為甘油、乳糖、海藻糖、脫脂乳中的一種 或幾種，優(yōu)選海藻糖。經(jīng)過冷凍干燥后，最終制備的凍干粉劑中酵母菌的存活率(存活率是 酵母菌中活細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比）不低于70%。
[0015] 本發(fā)明方法中，酵母菌凍干粉劑復(fù)溶或酵母菌同步培養(yǎng)液稀釋后的酵母菌懸液中 菌體濃度范圍為1〇 4~10s個/mL。酵母菌復(fù)溶或稀釋采用去離子水、生理鹽水或磷酸鹽緩 沖液，優(yōu)選去離子水。
[0016] 本發(fā)明方法中，酵母菌懸液與油田鉆井液測試樣品接觸時間為1~lOmin。
[0017] 本發(fā)明方法中，使用呂氏堿性美藍(lán)染液進(jìn)行染色處理；使用血球計數(shù)板和光學(xué)顯 微鏡對酵母菌活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行鏡檢計數(shù)并計算致死率。
[0018] 本發(fā)明方法中，以標(biāo)準(zhǔn)毒性物質(zhì)氯化汞確定生物毒性分級指標(biāo)。
[0019] 本發(fā)明方法中，若需測定包括pH影響在內(nèi)的油田鉆井液生物毒性，不應(yīng)調(diào)節(jié)測試 樣品pH值；若需測定排除pH影響在內(nèi)的油田鉆井液生物毒性，應(yīng)調(diào)節(jié)測試樣品pH值至 7. 0。本發(fā)明方法中，制備油田鉆井液測試樣品的濃度梯度為lOVg/UlOkg/LUO^ig/L、 103mg/L、10 4mg/L、105mg/L及106mg/L ;油田鉆井液樣品的稀釋液為去離子水。
[0020] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于： 1、通過不連續(xù)密度梯度離心和同步培養(yǎng)獲得了活性穩(wěn)定、形態(tài)均一的酵母菌，將該酵 母菌或者其凍干粉劑用于油田鉆井液生物毒性評價，實驗結(jié)果表明其對油田鉆井液生物毒 性評價結(jié)果與發(fā)光細(xì)菌法一致，可用于鉆井液生物毒性的快速評價。
[0021] 2、凍干粉劑便于酵母菌長期儲藏，保證了酵母菌的存活率不低于70%，也使本發(fā)明 方法實現(xiàn)了一次制備、多次使用，節(jié)省了后期油田鉆井液生物毒性評價實驗的準(zhǔn)備時間。
[0022] 3、本發(fā)明方法具有反應(yīng)靈敏高效、測試結(jié)果穩(wěn)定準(zhǔn)確、步驟易流程化、適用性強等 優(yōu)點，可以滿足油田開發(fā)及生產(chǎn)中對快速評價油田鉆井液生物毒性的需求。與現(xiàn)有評價方 法相比，時間縮短至lh以內(nèi)；并且可以直接使用酵母菌凍干粉劑，所使用的評價設(shè)備成本 低、方便攜帶，能夠在油田鉆井現(xiàn)場進(jìn)行油田鉆井液生物毒性評價實驗，具有流程化應(yīng)用前 旦
【具體實施方式】
[0023] 本發(fā)明中，采