一種瀕危羊躑躅多態(tài)性ssr分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)與應(yīng)用的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種顏危羊擲躅多態(tài)性SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)與應(yīng)用的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 羊擲躅(Rhododendron molle G.Don)，又名黃杜鵲、鬧羊花和八厘麻等，是中國(guó)羊 躑躅亞屬中僅有的一個(gè)原生種，具有較高的觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值。羊躑躅全株器官均含有 多種活性成分，其提取物可治療類風(fēng)濕、溫瘧、慢性腎小球腎炎和高血壓等，對(duì)血吸蟲(chóng)和多 種害蟲(chóng)也具有非常好的滅殺效果。
[0003] 上世紀(jì)80年代以前，羊躑躅遍及華中、華南，西南地區(qū)也有少量分布。但由于人們 的濫挖亂采及生境的破壞，羊躑躅的生殖環(huán)節(jié)受到嚴(yán)重影響，羊躑躅野外分布的地區(qū)和種 群數(shù)量急劇減少，棲息地已呈"島嶼化"，有些省份野外已難見(jiàn)其蹤影，羊躑躅瀕于滅絕的風(fēng) 險(xiǎn)日益加劇，亟待加以保護(hù)。
[0004] 遺傳多樣性分析是評(píng)價(jià)和保護(hù)稀有瀕危物種的重要指標(biāo)，能夠反映一個(gè)物種適應(yīng) 環(huán)境的能力和對(duì)環(huán)境變迀持續(xù)進(jìn)化的潛力和效應(yīng)，它能為確定瀕危植物優(yōu)先保護(hù)種群和制 定有效的取樣策略提供重要依據(jù)。簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR)，廣泛存 在于真核基因組中，具有共顯性、高度重復(fù)性、高度豐富性等優(yōu)點(diǎn)，是研究群體遺傳多樣性 的理想工具，但羊躑躅的多態(tài)性SSR分子標(biāo)記還很缺乏。為此本發(fā)明利用我們此前對(duì)羊躑躅 簡(jiǎn)化基因組測(cè)序(RAD-seq)的數(shù)據(jù)，合成SSR分子標(biāo)記引物，鑒定篩選一批多態(tài)性SSR分子標(biāo) 記，應(yīng)用這些多態(tài)性SSR分子標(biāo)記評(píng)估分析瀕危羊躑躅遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，為該物種的 保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)和參考。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種瀕危羊躑躅多態(tài)性SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)與應(yīng)用的方法， 提供一批可用于群體基因組學(xué)、系統(tǒng)發(fā)生學(xué)及比較基因組學(xué)等研究的SSR引物，應(yīng)用這些多 態(tài)性SSR分子標(biāo)記評(píng)估分析顏危羊擲躅遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，為該物種的保護(hù)提供科學(xué) 依據(jù)和參考。
[0006] 本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 1、羊躑躅SSR分子標(biāo)記的獲得：利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)瀕危羊躑躅 (Rhododendron molle G·Don)基因組進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)序列數(shù)據(jù)過(guò)濾、聚類和組裝等步驟，得到 171.5341^的基因組序列，包含498,252〇 〇的丨88，測(cè)序質(zhì)量合格，6(：分布正常，采用33時(shí)叟索 軟件對(duì)contig序列進(jìn)行SSR檢測(cè)搜索，最后從11，961微衛(wèi)星位點(diǎn)中開(kāi)發(fā)得到11，687331?分子 標(biāo)記；
[0008] 2、SSR分子標(biāo)記的篩選與合成：從11，687SSR分子標(biāo)記中選取94對(duì)SSR進(jìn)行遺傳多 樣性的篩選鑒定，SSR分子標(biāo)記初選的條件是2個(gè)堿基重復(fù)單元的SSR需要有10~15個(gè)拷貝 的重復(fù)，3個(gè)堿基重復(fù)單元的SSR需要有6~12個(gè)拷貝的重復(fù)，開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)好的SSR分子標(biāo)記引 物序列合成；
[0009] 3、羊躑躅多態(tài)性SSR的鑒定:采用不同地理分布的羊躑躅DNA對(duì)合成94對(duì)SSR引物 進(jìn)行PCR擴(kuò)增及聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，最后從94對(duì)SSR引物中獲得16對(duì)的多態(tài)性SSR分 子標(biāo)記，見(jiàn)表1;
[0010] 4、羊躑躅多態(tài)性SSR分子標(biāo)記的有效性評(píng)估:將篩選獲得16對(duì)多態(tài)性SSR標(biāo)記在2 個(gè)羊躑躅自然居群，每個(gè)居群含21個(gè)個(gè)體，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，評(píng)估分析了這16對(duì)多態(tài)性SSR標(biāo)記 能夠用于羊躑躅的遺傳多樣性分析和保護(hù)生物學(xué)研究，見(jiàn)表1;
[0011] 5、多態(tài)性SSR分子標(biāo)記應(yīng)用:運(yùn)用本研究獲得的多態(tài)性SSR分子標(biāo)記在8個(gè)羊擲躅 自然居群，含193個(gè)個(gè)體，進(jìn)行了遺傳多樣性分析，獲得了一些保護(hù)羊躑躅的科學(xué)依據(jù)，即羊 躑躅Shannon多樣性指數(shù)(I)為1.768，基因多樣性指數(shù)Η為0.777，江西省金溪縣居群的遺傳 變異最豐富，而福建政和的遺傳多樣性水平最低，見(jiàn)表2，PCA分析和UPGMA分析都表明8個(gè)自 然群體被分為兩組，江西永修居群獨(dú)立為一組，羊躑躅最好以就地保護(hù)為主，應(yīng)優(yōu)先保護(hù)金 溪、永修居群，同時(shí)增加對(duì)政和和京山居群的保護(hù)權(quán)重。
[0012] 本發(fā)明的技術(shù)效果是:本發(fā)明提供一批可用于群體基因組學(xué)、系統(tǒng)發(fā)生學(xué)及比較 基因組學(xué)等研究的SSR引物，應(yīng)用這些多態(tài)性 SSR分子標(biāo)記評(píng)估分析瀕危羊躑躅遺傳多樣性 和遺傳結(jié)構(gòu)，為該物種的保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)和參考。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為引物Η88在京山自然居群中的PCR擴(kuò)增的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果，該居群 共22個(gè)個(gè)體，每個(gè)個(gè)體擴(kuò)增效果良好。
[0014] 圖2為基于12對(duì)SSR分子標(biāo)記對(duì)8個(gè)羊躑躅自然居群擴(kuò)增電泳后，經(jīng)條帶統(tǒng)計(jì)，利用 Genalex 6.1和PowerMarker V3.25軟件進(jìn)行分析得到的羊擲躅群體間聚類圖，永修居群為 獨(dú)立居群。
[0015] 在圖中，JZ代表安徽金寨居群，PA為浙江磐安，YX為江西永修，JS為湖北京山，JX為 江西金溪，SD為湖南邵東，PY為江西鄱陽(yáng)，ZH為福建政和。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面將結(jié)合附圖1、2來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明所具有的有益效果，旨在幫助閱讀者更好 地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，但不能對(duì)本發(fā)明的實(shí)施和保護(hù)范圍構(gòu)成任何限定。
[0017] 1、羊躑躅SSR分子標(biāo)記的獲得:采用改良的2XCTAB法，提取羊躑躅幼嫩葉片中的 基因組DNA，檢測(cè)合格的DNA樣品交于北京諾禾致源生物信息科技有限公司，采用Illumina HiSeq/MiSeq(11 lumina HiSeq?2500/Miseq?測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組技術(shù)(RAD-seq)，測(cè) 序完成后的Raw Data或Raw Reads，經(jīng)序列數(shù)據(jù)質(zhì)控、過(guò)濾，用cd-hit-est聚類軟件進(jìn)行聚 類，用￥61代切?^!114打組裝軟件對(duì)篩選過(guò)后的每類測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，得到171.534113的 基因組序列，包含498，252 contigs，采用SSR搜索軟件對(duì)contig序列進(jìn)行SSR檢測(cè)搜索，最 后從11,961微衛(wèi)星位點(diǎn)中開(kāi)發(fā)得到11，687SSR分子標(biāo)記；
[0018] 2、SSR分子標(biāo)記的篩選與合成：從11，687SSR分子標(biāo)記中選取94對(duì)SSR進(jìn)行羊擲躅 的遺傳多樣性的篩選鑒定，SSR分子標(biāo)記初選的條件是2個(gè)堿基重復(fù)單元的SSR需要有10~ 15個(gè)拷貝的重復(fù)，3個(gè)堿基重復(fù)單元的SSR需要有6-12個(gè)拷貝的重復(fù)，開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)好的SSR分子 標(biāo)記引物序列合成；
[0019] 3、羊躑躅多態(tài)性SSR的PCR擴(kuò)增與鑒定:2014年和2015年的4月~5月，采集8個(gè)羊躑 躅自然居群，合計(jì)193份羊躑躅的幼葉，包括江西省的金溪縣，鄱陽(yáng)縣和永修縣，福建省的政 和縣，安徽省的金寨縣，湖南省的邵東縣，湖北省的京山縣，浙江省的磐安縣，采用改良的2 XCTAB法，提取羊躑躅幼嫩葉片中的基因組DNA，從不同居群中選取8個(gè)羊躑躅個(gè)體的DNA對(duì) 合成94對(duì)SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，PCR擴(kuò)增體系（15μ1)如:7.5μ1 2XTaq PCR green mix(北京鼎國(guó)昌盛生