一種苯丙素類化合物的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，設(shè)及一種新苯丙素類化合物的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 從天然藥物中提取分離得到的成分結(jié)構(gòu)多樣、活性顯著，對其進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu) 修飾、改造和全合成，一直是新藥研發(fā)的一個主要思路。
[0003] TNF-a:是一種能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對正常細(xì)胞無明顯毒性的細(xì)胞因子，是迄 今為止所發(fā)現(xiàn)的直接殺傷腫瘤作用最強(qiáng)的生物活性因子之一，然而其毒副作用也非常嚴(yán) 重。
[0004] IL-Ιβ:在局部低濃度時協(xié)同刺激APC和T細(xì)胞活化，促進(jìn)B細(xì)胞增殖和分泌抗體，進(jìn) 行免疫調(diào)節(jié)。大量產(chǎn)生時有內(nèi)分泌效應(yīng):誘導(dǎo)肝臟急性期蛋白合成，引起發(fā)熱和惡病質(zhì)。
[0005] 比-6:人類化-6基因位于第7號染色體上；比-6分子量在21~30KD之間。主要由單 核巨隧細(xì)胞、Th2細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生。能夠刺激活化B細(xì)胞增殖，分泌抗 體;刺激T細(xì)胞增殖及CTL活化;刺激肝細(xì)胞合成急性期蛋白，參與炎癥反應(yīng);促進(jìn)血細(xì)胞發(fā) 育。
[0006] IL-6可由多種細(xì)胞合成，包括活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞、單核一巨隧細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、 上皮細(xì)胞W及成纖維細(xì)胞等?；?6作用的祀細(xì)胞很多，包括巨隧細(xì)胞、肝細(xì)胞、靜止的T細(xì) 胞、活化的B細(xì)胞和漿細(xì)胞等;其生物效應(yīng)也十分復(fù)雜。
[0007] 0H為生物系統(tǒng)中最具活性的活性氧物質(zhì)，能導(dǎo)致細(xì)胞及生物體內(nèi)DNA，蛋白質(zhì)和脂 質(zhì)氧化損傷。
[000引因此，尋求一種新的制備方法，從天然植物中提取分離得到新的化合物，能抑制細(xì) 胞炎癥因子TNF-a，化-1β，比-6的表達(dá)作用，抑制徑基自由基(-OH)的活性，應(yīng)用于炎癥性疾 病的治療，是非常有必要的。
[0009] 千斤拔藥材為豆科(Xeguminosae)千斤拔屬(Flemingl .Roxb.或Mo曲ania)植物大 葉千斤拔(Moghaniamac;rophylla(Willd.)O.Kuntze)的干燥根，在我國主要分布于東南部 地區(qū)。該植物在中國植物志（1995,41:313)、臺灣植物志（1977,3:258)、海南植物志（1965， 2:311)、《中國高等植物圖鑒》（1972,2:510)、中國主要植物圖說（1955，口口707)和廣州植物 志（1956，pp361)中均有收錄。千斤拔藥材為廣西地區(qū)的道地藥材，史載于《植物名實(shí)圖考》， 有著廣泛的民間用藥基礎(chǔ)。其性味甘，微澀，平，具有清熱除濕等功效，主要用于治療風(fēng)濕骨 痛、跌打損傷、慢性腎炎、痛經(jīng)和白帶多等婦科疾病。該藥材目前已收載入2005年版《中國藥 典》附錄。
[0010] 大葉千斤拔已報(bào)道的成分主要有黃酬類、醬類、祗類、蔥釀類、揮發(fā)油類成分，均具 有一定的藥理活性。
[0011] 大葉千斤拔藥理活性多樣，報(bào)道較多的有神經(jīng)保護(hù)作用，抗炎、抗氧化作用，對病 原微生物的驅(qū)蟲作用、類激素作用、細(xì)胞毒作用，抗菌作用W及免疫增強(qiáng)作用、抗疲勞作用。
[0012] 千斤拔目前廣泛應(yīng)用于婦科、風(fēng)濕搏痛等類型的中成藥生產(chǎn)，如婦科千金片、婦科 千金膠囊、金雞沖劑、金雞膠囊等，此類中成藥主要用于婦科病(痛經(jīng)、子宮寒冷不孕、子宮 下垂、盆腔炎、乳腺炎、白帶多、產(chǎn)后血虛、關(guān)節(jié)痛、產(chǎn)后腰膝痛、缺乳和乳瘡等），虛弱貧血 (婦女貧血，氣血虛弱和病后氣虛等）。近年來，臨床報(bào)道較多的是婦科千金片在治療婦科炎 癥方面的作用。
[0013] 目前，在千斤拔的文獻(xiàn)中，報(bào)道苯丙素類化合物的文獻(xiàn)極少，尋找一種新的制備方 法，從天然植物中分離出有效的苯丙素類新化合物，對其進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)修飾和合成， 開發(fā)新藥，應(yīng)用于炎癥性疾病的治療，意義重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明的目的在于提供一種從大葉千斤拔的干燥根中分離得到的一種新苯丙素 類化合物的制備方法，通過該制備方法提取分離得到的化合物可W抑制細(xì)胞炎癥因子了^- α，IL-Ιβ，IL-6的表達(dá)作用，具有對徑基自由基的（-OH)的抑制作用，進(jìn)而具有抗炎及抗氧化 活性，有益于各種炎癥性疾病的治療，可W將該化合物開發(fā)成新藥。
[0015] 具體地，本發(fā)明所述苯丙素類化合物的制備方法包括如下步驟：
[0016] S1.取大葉千斤拔的根部為原料，干燥，切塊，經(jīng)乙醇溶液提取，將提取液合并，濃 縮至無醇味，得浸膏備用；
[0017] S2.將步驟S1中所得浸膏加水溶解，采用大孔吸附樹脂柱對其進(jìn)行洗脫，洗脫劑為 乙醇-水系統(tǒng)，收集前3個柱體積的洗脫液，命名為ΜΜ-1，備用；
[0018] S3 .將步驟S2中收集到的流分ΜΜ-1用反相材料0DS柱層析進(jìn)行洗脫，洗脫劑為甲 醇-水系統(tǒng)，洗脫18個柱體積，按每3個柱體積收集一個流分的洗脫液，按順序收集6個流分， 分別命名為匪-11，11-12，11-13，11-14，11-15，11-16，備用；
[0019] S4.將步驟S3中收集到的流分ΜΜ-13用制備液相分離，流動相為甲醇-水-乙酸系 統(tǒng)，按出峰順序收集洗脫液，共收集4個流分，分別命名為匪-131，匪-13 2，ΜΜ-13 3，ΜΜ-134， 備用；
[0020] S5.將步驟S4中收集到的流分ΜΜ-132用制備液相純化，流動相為甲醇-水-乙酸系 統(tǒng)，收集洗脫液，重結(jié)晶后得到所述苯丙素類化合物。所述苯丙素類化合物的純度為 99.45%。所述苯丙素類化合物的結(jié)構(gòu)式如式(1)所示：
[0021]
[0022] 優(yōu)選地，步驟S1中，乙醇溶液的濃度為50~80體積％，進(jìn)一步優(yōu)選為乙醇溶液濃度 為60體積％。
[0023] 優(yōu)選地，步驟S1中，乙醇溶液的提取次數(shù)為2~4次，每次提取1~3小時，進(jìn)一步優(yōu) 選為乙醇溶液的提取次數(shù)為3次，每次2小時。
[0024]優(yōu)選地，步驟S2中，大孔吸附樹脂采用DlOl大孔吸附樹脂。
[002引優(yōu)選地，步驟S2中，乙醇與水的體積比為0:100~15:85。
[00%] 優(yōu)選地，步驟S3中，甲醇與水的體積比為20:80~30:70，進(jìn)一步優(yōu)選為25:75。
[0027] 優(yōu)選地，步驟S4中，甲醇-水-乙酸的體積比為10:90:0.01~35:65:0.01，進(jìn)一步 [002引優(yōu)選為 15:85:0.01。
[0029] 優(yōu)選地，步驟S4中，制備液相色譜柱為YMC，20mm*250mm，流動相流速為5~10ml/ min,進(jìn)一步優(yōu)選為流速5ml/min。
[0030] 優(yōu)選地，步驟S5中，甲醇-水-乙酸的體積比為15:85:0.01。
[0031] 優(yōu)選地，步驟S5中，制備液相色譜柱為YMC，20mm*250mm，流動相流速為5mL/min。
[0032] 本發(fā)明提供所述制備方法制備得到的苯丙素類化合物。
[0033] W及W所述苯丙素類化合物為原料經(jīng)化學(xué)合成方法制備得到的苯丙素類化合物 鹽。所述鹽的結(jié)構(gòu)如式（Π )或式(虹)所示：
[0034]
[0035] 其中，R為無機(jī)酸，Ri或化為橫酸根、堿金屬離子或錠根中的任意一種或任意兩種。
[0036] 優(yōu)選地，所述無機(jī)酸為鹽酸、氨漠酸、氨氣酸、氨艦酸、硫酸、硝酸、簇酸、憐酸或乳 酸;所述橫酸根為具有芳基的橫酸根;所述堿金屬離子為鐘離子、鋼離子、巧離子、儀離子或 裡離子。
[0037] 優(yōu)選地，所述具有芳基的橫酸根為苯橫酸根或?qū)妆綑M酸根。
[0038] 優(yōu)選地，所述藥學(xué)上可接受的鹽為錠鹽。
[0039] 本發(fā)明的有益效果：
[0040] 本發(fā)明為新的苯丙素類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽提供了一種制備方法，首次 從大葉千斤拔的干燥根中分離得到的一種新苯丙素類化合物，制得的化合物可w抑制細(xì)胞 炎癥因子TNF-a，比-1β，比-6的表達(dá)作用，具有對徑基自由基的（-OH)的抑制作用，進(jìn)而具有 抗炎及抗氧化活性，可W用作如宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、乳腺炎、咽喉炎和/或關(guān)節(jié)炎 等炎癥性疾病的治療藥物。
[0041 ]本發(fā)明的目的是從傳統(tǒng)的中藥處方中，通過從婦科千金片及婦科千金膠囊的處方 中，通過溶劑提取、柱層析分離、制備液相分離、純化制得一種新苯丙素類化合物，并通過實(shí) 驗(yàn)證實(shí)，其可W應(yīng)用于炎癥性疾病，如宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、乳腺炎、咽喉炎和/或關(guān) 節(jié)炎等疾病的治療。
[0042] 具體地，發(fā)明人通過從婦科千金片、婦科千金膠囊的處方中，科學(xué)選取大葉千斤拔 的干燥根，通過溶劑提取、柱層析分離、制備液相分離、純化，得到本發(fā)明所述苯丙素類化合 物，然后對該化合物進(jìn)行細(xì)胞試驗(yàn)，測定其對細(xì)胞炎癥因子TNF-a，比-10，化-6的抑制程度， 實(shí)驗(yàn)表明，該化合物在濃度(7.50 -13.50yg/mL)范圍內(nèi)對LPS刺激引起的Raw 264.7細(xì)胞炎 癥因子TNF-a含量有明顯的抑制作用(P<0.05)，并且表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系;在濃度 (10.50-13.504邑/血)范圍內(nèi)對炎癥因子化-1|3和比-6含量有明顯的抑制作用(口<0.05)，表 現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系。
【附圖說明】
[0043] 圖1為本發(fā)明所述苯丙素類化合物的核磁共振氨譜圖。
[0044] 圖2為本發(fā)明所述苯丙素類化合物的核磁共振碳譜圖。
[0045] 圖3為本發(fā)明所述苯丙素類化合物對細(xì)胞活性的影響圖。
[0046] 圖4為本發(fā)明所述苯丙素類化合物對NO的抑制作用圖。
[0047] 圖5為本發(fā)明所述苯丙素類化合物對TNF-a的抑制作用圖。
[0048] 圖6為本發(fā)明所述苯丙素類化合物對IL-Ιβ的抑制作用圖。
[0049] 圖7為本發(fā)明所述苯丙素類化合物對IL-6的抑制作用圖。
[0050] 圖8為本發(fā)明所述苯丙素類化合物對0哺勺抑制作用圖。
【具體實(shí)施方式】
[0051] W下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明 做任何形式的限定。除非特別說明，本