一種鈣化癌細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鈣化癌細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是世界上死亡率最高的疾病之一，而且保持持續(xù)的高發(fā)病率。目前國(guó)際醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的癌癥治療的方法仍然是傳統(tǒng)的化療和放療，然而放、化療藥物在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，會(huì)使機(jī)體遭受嚴(yán)重的損傷，例如腎臟衰竭、脫發(fā)、消瘦等。此外，腫瘤轉(zhuǎn)移是引起癌癥患者死亡的重要原因，患者因其腫瘤轉(zhuǎn)移引起的器官衰竭致死占有較高比例，而放化療藥物不能有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年癌癥的治療費(fèi)用很高，且呈逐年增加的趨勢(shì)，給患者家庭造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和心理負(fù)擔(dān)。
[0003]盡管目前有多種新興技術(shù)用于癌癥治療，例如采用藥物載體的方式，通過控制載體的尺寸和表面修飾腫瘤特異性識(shí)別分子，使藥物富集在腫瘤組織中，但是其載體具有免疫原性，當(dāng)載體進(jìn)入血液后，很快被體內(nèi)免疫系統(tǒng)識(shí)別并被清除，從而失去治療效果。近年來隨著科學(xué)研究的深入，不斷有新藥進(jìn)入市場(chǎng)，2015年上市的抗癌藥物(Nivolumab)是基于細(xì)胞程序性死亡蛋白PD-1設(shè)計(jì)的小分子藥物，在臨床試驗(yàn)中取得顯著效果，且沒有明顯副作用，然而這些藥物在研發(fā)階段的高成本的投入，使藥物的價(jià)格較為昂貴。據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院統(tǒng)計(jì)得出，到2005年，美國(guó)癌癥的治療費(fèi)約為2094億元，在2014年的癌癥支出費(fèi)用約占國(guó)民生產(chǎn)醫(yī)療總值的20%，由此可看出，患者在使用此藥物時(shí)將承擔(dān)高昂的醫(yī)藥費(fèi)。腫瘤的轉(zhuǎn)移是其難以治愈的重要原因，而目前諸多抗癌藥物中，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物嚴(yán)重不足，使得許多患者在治療后又出現(xiàn)轉(zhuǎn)移瘤時(shí)束手無策。因此，尋找一種安全有效且經(jīng)濟(jì)的方法抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移迫在眉睫。
[0004]在人體中，鈣化在骨骼和牙齒的生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用，但是血管的病理的鈣化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的功能紊亂，最終引發(fā)一系列的疾病，如慢性腎臟病變以及心血管病變等。如果將鈣化引入到癌細(xì)胞表面則可能會(huì)抑制癌細(xì)胞的活性或最終導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡，由此可為癌癥治療提供一種不依賴藥物的新思路。在我們之前的研究中，我們采用化學(xué)修飾的方法實(shí)現(xiàn)了酵母細(xì)胞壁的鈣化，鈣化會(huì)使酵母細(xì)胞進(jìn)入休眠期停止分裂，這是由于酵母細(xì)胞具有良好的抗脅迫能力，而對(duì)比哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，哺乳細(xì)胞細(xì)胞膜較脆弱且沒有細(xì)胞壁保護(hù)，并且有研究表明在細(xì)胞表面硅化形成一層Si02后，細(xì)胞的時(shí)間不超過12h，說明在細(xì)胞膜外層形成一層礦物，會(huì)嚴(yán)重影響哺乳動(dòng)物細(xì)胞的活性。與正常組織細(xì)胞不同，癌細(xì)胞表面有許多特異性表達(dá)的分子受體，如葉酸受體(FR)，而FR在正常組織細(xì)胞中幾乎沒有表達(dá)，而它的配體葉酸(FA)，恰好含有能促進(jìn)鈣化的羧基。因此，利用癌細(xì)胞高度表達(dá)葉酸受體的特性，尋求導(dǎo)致癌細(xì)胞鈣化的方法，將是抑制腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的有效手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種鈣化癌細(xì)胞的方法，利用該方法在癌細(xì)胞表面形成礦物層，達(dá)到抑制癌細(xì)胞活性的目的。
[0006]—種鈣化癌細(xì)胞的方法，包括以下步驟:
[0007](I)將癌細(xì)胞接種于含有葉酸的培養(yǎng)基中，孵育，得到表面富集葉酸的癌細(xì)胞；
[0008](2)將表面富集葉酸的癌細(xì)胞置于鈣化液中孵育，制得鈣化的癌細(xì)胞。
[0009]本發(fā)明基于癌細(xì)胞表面高表達(dá)葉酸受體的特性，將癌細(xì)胞接種到含有葉酸的培養(yǎng)基中，使葉酸富集于癌細(xì)胞表面，提高癌細(xì)胞表面的羧基含量。羧基為鈣化提供成核和晶體生長(zhǎng)的活性位點(diǎn)，導(dǎo)致癌細(xì)胞鈣化。
[0010]按照本發(fā)明的技術(shù)方法處理后得到的鈣化癌細(xì)胞經(jīng)掃描電鏡和能譜元素分析表征鈣化層的成分為磷酸鈣，是由許多微、納米級(jí)磷酸鈣團(tuán)簇交聯(lián)而成，并粘附在細(xì)胞膜表面。磷酸鈣覆蓋于癌細(xì)胞的表面，限制了癌細(xì)胞的生理活動(dòng)，使癌細(xì)胞活性受到明顯抑制，并最終導(dǎo)致細(xì)胞膜的破裂。
[0011]作為優(yōu)選，重復(fù)操作步驟(2)數(shù)次，得到鈣化的癌細(xì)胞。重復(fù)添加新鮮的鈣化液，使鈣離子、磷酸根離子不斷地在羧基位點(diǎn)上反應(yīng)沉淀，在癌細(xì)胞表面沉積更多的磷酸鈣。更為優(yōu)選的，重復(fù)操作步驟(2) 2?5次。
[0012]作為優(yōu)選，所述癌細(xì)胞為人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、人乳腺癌細(xì)胞(MCF7)或人卵巢細(xì)胞(SKV0-3)。研究證明這三類細(xì)胞的葉酸受體是過度表達(dá)的，有利于鈣化層的沉積。宮頸癌、乳腺癌和卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤，對(duì)于這三類癌細(xì)胞實(shí)現(xiàn)鈣化，對(duì)于腫瘤的治療具有指導(dǎo)意義。
[0013]為了最大限度地富集葉酸，癌細(xì)胞需與培養(yǎng)基充分的接觸，因此癌細(xì)胞的接種密度不宜過大，作為優(yōu)選，癌細(xì)胞的接種密度為長(zhǎng)至培養(yǎng)孔板底面面積的40-80 %。更為優(yōu)選的，接種密度占培養(yǎng)孔板底面面積的60-70%。這樣既保證癌細(xì)胞與培養(yǎng)基有效接觸，又能夠充分利用培養(yǎng)孔板。
[0014]作為優(yōu)選，癌細(xì)胞在接種前使用磷酸緩沖液清洗2-3次。癌細(xì)胞鈣化處理前先進(jìn)行清洗，避免其他物質(zhì)對(duì)鈣化效果造成影響。
[0015]葉酸為鈣化提供成核和晶體成長(zhǎng)的活性位點(diǎn)，因此，需保證培養(yǎng)基中含有足夠量的葉酸，作為優(yōu)選，步驟(I)中，培養(yǎng)基中葉酸的含量為0.2-1.2mg/mL。培養(yǎng)基為常規(guī)的癌細(xì)胞培養(yǎng)基。如DMEM培養(yǎng)基。更為優(yōu)選，培養(yǎng)基中葉酸的含量為0.5-lmg/mL。
[OO10]作為優(yōu)選，步驟(I)中，孵育的時(shí)間為5-30min。更為優(yōu)選的，孵育的時(shí)間為10-25min0
[0017]作為優(yōu)選，步驟(2)中，所述鈣化液為鈣離子濃度為5-20mM的DMEM培養(yǎng)基。
[0018]DMEM培養(yǎng)基作為磷酸根來源，通過外加鈣離子，在細(xì)胞膜表面形成磷酸鈣(CaP)鈣化層。鈣離子濃度太低，很難形成沉淀，但是高于20mM會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用。更為優(yōu)選的，DMEM培養(yǎng)基中鈣離子濃度為10-15mM。
[0019]作為優(yōu)選，步驟(2)中，孵育時(shí)間為0.25_2h。孵育時(shí)間不宜太久，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，鈣離子對(duì)細(xì)胞的毒性也會(huì)增加。更為優(yōu)選為0.5-lh。
[0020]二氧化碳加速磷酸鈣的形成，因此，在孵育過程中通入二氧化碳，二氧化碳會(huì)有少量溶于液體，與葉酸富集的鈣離子結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)沉淀形成。作為優(yōu)選，孵育條件包括二氧化碳的濃度為4-10 %。
[0021]本發(fā)明還提供了葉酸在制備癌細(xì)胞鈣化誘導(dǎo)劑中的應(yīng)用。
[0022]本發(fā)明具備的有益效果:(I)本發(fā)明基于癌細(xì)胞高度表達(dá)葉酸受體以及葉酸羧基為鈣化提供成核位點(diǎn)的特性，在癌細(xì)胞表面形成磷酸鈣鈣化層，可抑制細(xì)胞活性，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)并最終導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡；(2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明的鈣化處理對(duì)血液細(xì)胞沒有影響，沒有肝毒性，且對(duì)器官幾乎沒有損傷，具有較好的生物安全性，因此，本發(fā)明的技術(shù)方案為腫瘤治療提供可行的方案。
【附圖說明】
[0023]圖1為人正常細(xì)胞HEK293和人宮頸癌細(xì)胞HeLa鈣化后光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果。
[0024]圖2為人正常細(xì)胞HEK293和人宮頸癌細(xì)胞HeLa鈣化后SEM觀察(A)和HeLa鈣化細(xì)胞鈣、磷元素成像結(jié)果(B)。
[0025]圖3為HeLa細(xì)胞鈣化層CaP的SEM放大觀察，其中A為放大5000倍，B為放大50000倍。
[0026]圖4為鈣化細(xì)胞樣品的表征結(jié)果圖，其中A為X-射線衍射分析(XRD)，B為傅里葉紅外變換光譜分析(FTIR)。
[0027]圖5為HeLa細(xì)胞鈣化后不同時(shí)間的激光共聚焦觀察結(jié)果，其中綠色熒光為鈣化層的磷酸鈣(鈣黃綠素染色)，紅色為細(xì)胞膜(PKH26染色)，藍(lán)色為細(xì)胞核(H0echeSt33342染色)。
[0028]圖6為HeLa細(xì)胞鈣化24h后的死活染色結(jié)果圖(A)和HEK293和HeLa細(xì)胞鈣化后24h的存活率MTT結(jié)果(B)，其中A中上圖為HeLa細(xì)胞未鈣化的染色結(jié)果，結(jié)果顯示是活細(xì)胞，下圖為HeLa細(xì)胞?丐化24h后的染色結(jié)果，結(jié)果顯不是死細(xì)胞。
[0029]圖7為小鼠體內(nèi)腫瘤組織的靶向鈣化結(jié)果，其中A圖為不同處理組的腫瘤組織光學(xué)拍照結(jié)果;B圖為鈣化腫瘤組織的micro-CT結(jié)果；C圖為鈣化后腫瘤組織切片的TEM觀察結(jié)果，紅色雙向箭頭指示細(xì)胞間隙，在細(xì)胞間存在大量磷酸鈣;D圖為腫瘤組織切片熒光染色后的激光共聚焦結(jié)果圖，藍(lán)色為H0echst33342染色的細(xì)胞核。
[0030]圖8為靶向鈣化對(duì)小鼠的安全性評(píng)價(jià)，其中A為小鼠血液血常規(guī)分析結(jié)果;B為小鼠肝功能生化分析結(jié)果;C為小鼠主要器官的HE染色結(jié)果。
[0031]圖9為靶向鈣化用于小鼠體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中A為不同處理組的小鼠腫瘤生長(zhǎng)的體積變化;B為小鼠體重變化;C為小鼠腫瘤組織的HE染色結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0032]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。這些實(shí)施例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明使用范圍。實(shí)驗(yàn)中DMEM培養(yǎng)基為商品化產(chǎn)品，所用的葉酸(FA)、無機(jī)鹽、有機(jī)小分子以及蛋白質(zhì)均為化學(xué)純以上進(jìn)口試劑。
[0033]實(shí)施例1
[0034]一、靶向鈣化癌細(xì)胞一甲的制備
[0035]將HeLa細(xì)胞鋪于24孔板中，每孔細(xì)胞個(gè)數(shù)約為2X 105，待細(xì)胞長(zhǎng)到孔板底部面積的70%左右，開始鈣化處理。首先倒掉細(xì)胞的培養(yǎng)基，PBS清洗1-2次，然后向孔板中加入含300yg/mL FA的DMEM培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)⑶2濃度為5 %、空氣95 %，溫度37°C，孵育15min后，向孔板中加入含有11.8mM Ca2+(包括新加入的1mM CaCl2)的DMEM培養(yǎng)基的鈣化液，將孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中鈣化處理30min，吸掉鈣化液加入新鮮鈣化液繼續(xù)處理60min。以FA和鈣化液?jiǎn)为?dú)處理作為對(duì)照，處理完成后將溶液吸掉，即可得到鈣化的癌細(xì)胞。
[0036]三、靶向鈣化癌細(xì)胞一乙的制備
[0037]將HeLa細(xì)胞鋪于24孔板中，每孔細(xì)胞個(gè)數(shù)約為2X 105，待細(xì)胞長(zhǎng)到孔板底部面積的70%左右，開始鈣化處理。首先將細(xì)胞的培養(yǎng)基換掉，用pH7.2的磷酸緩沖液清洗1-2次，然后向孔板中加入額外新加入200yg/mL FA的DMEM培養(yǎng)基，然后將細(xì)胞至于培養(yǎng)箱中調(diào)節(jié)CO2濃度為5 %、空氣95 %，溫度37 0C，在培養(yǎng)箱中孵育20min后，吸掉培養(yǎng)基，向孔板中加入含有21.8mM Ca2+(包括新加入的20mM CaCl2)的DMEM培養(yǎng)基的鈣化液，將孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中鈣化處理30min。以FA和鈣化液?jiǎn)为?dú)處理作為對(duì)照，處理完成后將溶液吸掉，即可得到鈣化的癌細(xì)胞。
[0038]三、靶向鈣化癌細(xì)胞一丙的制備
[0039]將HeLa細(xì)胞鋪于24孔板中，每孔細(xì)胞個(gè)數(shù)約為2X 105，待細(xì)胞長(zhǎng)