一種臍帶動(dòng)脈和靜脈血管周干細(xì)胞的制備和保存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種臍帶血管壁制備和保存間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，從血管周圍組織分離間充質(zhì)干細(xì)胞。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)認(rèn)識(shí)到成體干細(xì)胞可以作為組織工程、細(xì)胞治療或基因治療的種子細(xì)胞，但仍然存在異體移植免疫排斥、來(lái)源困難、體外擴(kuò)增不易控制等成體干細(xì)胞應(yīng)用的主要障礙。分離擴(kuò)增成體干細(xì)胞以提供充足的可移植細(xì)胞，是應(yīng)用的關(guān)鍵。
[0003]間充質(zhì)干細(xì)胞是成體干細(xì)胞的一種，來(lái)源于發(fā)育早期中胚層，因具有高度自我更新、免疫調(diào)控和多向分化潛能而備受關(guān)注。間充質(zhì)干細(xì)胞廣泛存在于全身各種組織中，特別是骨髓、脂肪組織、臍血。臨床研究中的間充質(zhì)干細(xì)胞主要來(lái)自骨髓。目前傳統(tǒng)的方法是在全麻或椎管內(nèi)麻醉下從骨髓中取得干細(xì)胞，但每毫升的骨髓中僅能獲取100?1000集落生成單位的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，且必須經(jīng)過(guò)體外擴(kuò)增才能獲得臨床需要的細(xì)胞數(shù)目，此方法不僅價(jià)格昂貴，增加患者痛苦，而且需消耗較長(zhǎng)的治療時(shí)間，限制了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用前景。
[0004]2003年，Mitchell等首先證實(shí)了從臍帶提取的間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能，隨后又有多名學(xué)者從臍帶華通膠中分離到成纖維樣細(xì)胞，并證實(shí)其具有自我更新增殖及多向分化潛能，命名為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)(human umbilical cord mesenchymal stemcells’hUC-MSCshhUC-MSCs是指存在于臍帶中的間充質(zhì)干細(xì)胞，臍帶作為分娩廢棄物，相比其它間充質(zhì)干細(xì)胞，hUC-MSCs具有亞全能分化潛能，其獲取簡(jiǎn)單、來(lái)源豐富、培植過(guò)程也比其它干細(xì)胞快約I倍，生長(zhǎng)均勻，具有很多作為種子細(xì)胞的優(yōu)良特性，如增殖活性高、免疫原性低、無(wú)致瘤性等，來(lái)源充足，無(wú)倫理問(wèn)題等的優(yōu)勢(shì)。hUC-MSCs在再生醫(yī)學(xué)和組織工程學(xué)中的潛力，已經(jīng)引起了人們很大興趣，與來(lái)自骨髓的MSCs相比，hUC-MSCs具有優(yōu)越性，hUC表面為羊膜被覆上皮，其中包含兩個(gè)動(dòng)脈和一個(gè)靜脈，臍帶血管周圍環(huán)繞著粘液樣結(jié)締組織(稱為華通氏膠，WJ)。
[0005]臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的來(lái)源包括羊膜、羊膜下層、華通氏膠、臍帶血管、臍帶血管周圍組織和臍血。目前臨床上廣泛應(yīng)用的是華通氏膠來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，但是近年臍帶血管周干細(xì)胞因其高增殖活性、高克隆形成力和多向分化潛能，被認(rèn)為是間充質(zhì)干細(xì)胞的祖細(xì)胞，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。2013年，Tsang WP等研究指出，⑶146+的血管周細(xì)胞可作為骨再生的細(xì)胞來(lái)源。
[0006]目前人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的研究方面尚有缺陷。主要包括:
[0007](I)臍帶采集后臍靜、動(dòng)脈血液凝固，加大臍帶處理的難度，同時(shí)血細(xì)胞過(guò)多增加干細(xì)胞污染的機(jī)會(huì)；
[0008](2)組織貼壁法是將臍帶切割為細(xì)小組織塊直接貼附于培養(yǎng)基上，一般15天左右可獲得原代細(xì)胞;這種方法的缺點(diǎn)在于，周期長(zhǎng);組織塊易漂起，使其喪失了長(zhǎng)出細(xì)胞的能力，減少了細(xì)胞數(shù)量，此外細(xì)胞純度不足；
[0009](3)酶消化法多采用膠原酶與胰蛋白酶并用，雖然周期短，但是費(fèi)用高，條件不易掌握，常溫消化時(shí)間長(zhǎng)則可能損傷細(xì)胞，消化時(shí)間短則液體粘稠，難以通過(guò)離心獲得足夠量細(xì)胞，而且增加了臨床應(yīng)用過(guò)程中動(dòng)物源性蛋白引起過(guò)敏反應(yīng)和交叉感染的安全風(fēng)險(xiǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、凍存技術(shù)中的問(wèn)題和不足，本發(fā)明的目的是提供一種不采用消化酶又不同于常規(guī)貼壁法的臍帶血管周間充質(zhì)干細(xì)胞制備以及培養(yǎng)、凍存方法，克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，增加新的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源。
[0011]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的的，一種臍帶動(dòng)脈和靜脈血管周干細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟:
[0012]I)在無(wú)菌條件下于健康產(chǎn)婦分娩后立即取新生兒臍帶，擠出臍帶血管內(nèi)血液，將其放入提前盛有含5 %青鏈雙抗、I %肝素、磷酸鹽緩沖鹽的廣口瓶中，放在4 0C保存，4h內(nèi)進(jìn)行臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)；
[0013]2)從步驟I)中廣口瓶中取出新生兒臍帶，剪去有鉗夾痕及血腫的部分，擠出臍帶中的血，用剪刀修齊兩斷面，用眼科剪將臍帶縱向剪開，用鑷子鈍性分離動(dòng)脈血管和靜脈血管，將血管外膜周圍緊貼血管的膠組織剔除干凈；
[0014]3)步驟2)處理后將臍動(dòng)脈、臍靜脈分別用預(yù)熱的磷酸鹽緩沖鹽清洗，將血跡完全洗凈；用剪刀將臍靜脈、臍動(dòng)脈剪成約0.5cm的小段，分別在培養(yǎng)皿中整齊排開，鈍性按壓，使組織塊盡可能緊貼在皿底；
[0015]4)步驟3)處理后放置在5%C02、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)，倒置培養(yǎng)3小時(shí)；
[0016]5)步驟4)處理后加入細(xì)胞培養(yǎng)液，然后置于5 % CO2 ^ 37 0C培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至4-5天時(shí)將培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱中取出，補(bǔ)加適量細(xì)胞培養(yǎng)液，每隔2-3天補(bǔ)加細(xì)胞培養(yǎng)液，至第11-14天時(shí)清除所有組織片并繼續(xù)培養(yǎng);此后每2-3天更換一次細(xì)胞培養(yǎng)液，所述細(xì)胞培養(yǎng)液由DMEM低糖、10 %胎牛血清、I %青鏈霉素雙抗組成；
[0017]6)當(dāng)培養(yǎng)皿中的貼壁細(xì)胞達(dá)到80%_90%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用適量磷酸緩沖鹽溶液清洗，加入0.25 %胰酶消化，置于5 % CO2、37 °C培養(yǎng)箱孵育60-90s，倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度;輕輕從側(cè)部拍打培養(yǎng)皿數(shù)下，加入適量的細(xì)胞培養(yǎng)液，反復(fù)吹打，使臍帶血管周干細(xì)胞盡可能混于消化液中；后將懸液吸至離心管中，1250rpm離心5min，棄上清，重新用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種于10mm培養(yǎng)皿中進(jìn)行傳代培養(yǎng);此后每2-3天換液一次，直至融合率達(dá)到80-90 %后，消化傳代；
[0018]7)擴(kuò)增后細(xì)胞進(jìn)行病原生物學(xué)檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行表型檢測(cè)。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的保存方法:包括以下步驟:將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞用0.25 %胰酶消化，1250rpm、5min離心收集細(xì)胞，負(fù)壓吸引器吸掉離心管中細(xì)胞上清，先沿離心管口稍下方側(cè)壁緩慢加入預(yù)計(jì)凍存液的一半，再將吸管的頭部伸入液面以下緩慢加入另一半凍存液后，輕輕吹打混勻后將細(xì)胞懸液分裝于凍存管中，所述凍存液由90%胎牛血清、10% 二甲基亞砜組成；凍存管置于4 °C保持30分鐘，然后置于-20°C下保持2小時(shí)，再置于-80°C下保持16-18小時(shí)后液氮罐長(zhǎng)期儲(chǔ)存。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0021]本發(fā)明操作均在嚴(yán)格無(wú)菌條件下進(jìn)行，臍帶采集后抗凝劑的使用有效避免了血液凝固造成的不便。本發(fā)明的方法比普通的貼片法獲得更高純度的華通氏膠來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞;不采用消化酶，避免了動(dòng)物源性蛋白引起的過(guò)敏反應(yīng)和交叉感染，而且非酶原消化法分離得到的臍帶血管周干細(xì)胞比華通氏膠來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞CD146陽(yáng)性率更高，在體外的成骨分化能力更強(qiáng)。溫度梯度降溫法凍存細(xì)胞，減少對(duì)細(xì)胞的傷害，提高凍存年限和細(xì)胞活性。
【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為本發(fā)明臍帶動(dòng)脈周MSC形態(tài)；
[0023]圖2為本發(fā)明臍帶靜脈周MSC形態(tài)；
[0024]圖3為本發(fā)明臍帶動(dòng)脈周MSC表型；
[0025]圖4為本發(fā)明臍帶靜脈周MSC表型；
【具體實(shí)施方式】
[0026]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明了，下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)該理解，這些描述只是示例性的，而并非要限制本發(fā)明的范圍。
[0027]實(shí)施例1
[0028](I)在無(wú)菌條件下于健康產(chǎn)婦經(jīng)陰道分娩后立即取新生兒臍帶，約30cm長(zhǎng)，擠出臍帶血管內(nèi)血液，將其放入提前盛有含5 %青鏈雙抗、I %肝素的PBS的廣口瓶中，放在4 °(:保存，4h內(nèi)進(jìn)行臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)；
[0029](2)取出新生兒臍帶，剪去有鉗夾痕及血腫的部分，擠出臍帶中的血，用剪刀修齊兩斷面。用眼科剪將臍帶縱向剪開，用鑷子鈍性分離靜脈血管和動(dòng)脈血管，注意將血管外膜周圍緊貼血管的組織剔除干凈；
[0030](3)臍動(dòng)脈、臍靜脈分別用預(yù)熱的PBS清洗，將血跡完全洗凈。用剪刀將臍動(dòng)脈、臍動(dòng)脈剪成約0.5cm的小段，分別在10mm培養(yǎng)皿中整齊排開，鈍性按壓，使組織塊盡可能緊貼在皿底；
[0031](4)不加細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)液，直接放置在5%C02、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)，倒置3小時(shí)；
[0032](5)加入間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM低糖+10%胎牛血清+1%青鏈霉素雙抗)2-3ml(淹沒(méi)組織片即可)，置于5 %CO2、37 °C培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至4-5天時(shí)將培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱中取出，補(bǔ)加適量細(xì)胞培養(yǎng)液(使組織淹沒(méi)即可)，后每隔2-3天補(bǔ)加細(xì)胞培養(yǎng)液(使組織塊淹沒(méi)即可)繼續(xù)培養(yǎng)，至第11-14天時(shí)清除所有組織片并繼續(xù)培養(yǎng);此后每2-3天進(jìn)行一次換液(100mm皿需細(xì)胞培養(yǎng)液8-10ml);
[0033](6)當(dāng)培養(yǎng)皿中的貼壁細(xì)胞達(dá)到80%-90%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用適量PBS清洗，加入1.5ml-2ml 0.25%胰酶消化，置于5%CO2、37°C培養(yǎng)箱孵育60_90s，倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度。輕輕從側(cè)部拍打培養(yǎng)皿數(shù)下，加入適量的細(xì)胞培養(yǎng)液(胰酶:培養(yǎng)液=1:3)，反復(fù)吹打，使臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞盡可能混于消化液中；后將懸液吸至15ml離心管中，1250rpm離心5min，棄上清，重新用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種于10mm培養(yǎng)皿中進(jìn)行傳代培養(yǎng);此后每2-3天換液一次，直至融合率達(dá)到80-90 %后，消化傳代；
[0034](7)將步驟(7)擴(kuò)增后細(xì)胞進(jìn)行病原生物學(xué)檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行表型檢測(cè)，表型結(jié)果見附圖。
[0035](8)必要時(shí)將步驟(7)擴(kuò)增后細(xì)胞進(jìn)行凍存?zhèn)溆?；?.2%胰酶消化，1250印111，51^11離心收集細(xì)