一種人類基因組33個(gè)基因座的復(fù)合擴(kuò)增試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種同時(shí)分析人基因組常染色體及Y染色體基因座的復(fù)合擴(kuò)增試劑 盒，特別設(shè)及一種人類基因組33個(gè)基因座的復(fù)合擴(kuò)增試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)是目前普遍應(yīng)用的分子遺傳標(biāo)記，其片段小易擴(kuò)增，適宜于 檢驗(yàn)微量和降解生物檢材，各基因座的擴(kuò)增條件相似而能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)合擴(kuò)增和自動化檢測， 因而具有靈敏、準(zhǔn)確、快速、信息量大等優(yōu)點(diǎn)，非常適用于建立DNA數(shù)據(jù)庫。上世紀(jì)90年代美 國FBI選擇了13個(gè)常染色體STR基因座（簡稱A-STR)用于建立DNA數(shù)據(jù)索引系統(tǒng)--CODIS (Combined DNA Index System):CSF1P0、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、 0165539、018551、021511^64、1'冊1、1?(^、￥胖4，目前該系統(tǒng)已被多個(gè)國家的0魁數(shù)據(jù)庫在其 基礎(chǔ)上借鑒和發(fā)展。
[0003] 人類Y染色體是小的近端著絲粒染色體，它由長臂和微小的短臂兩部分組成。Y染 色體除擬常染色體區(qū)外，在減數(shù)分裂中不發(fā)生交換重組，呈單倍型獨(dú)立向下傳遞，表現(xiàn)出父 系遺傳特征，其序列的變異完全由累積的突變所致。Y染色體STR基因座(簡稱Y-STR)是指存 在于人類Y染色體非重組區(qū)域的短串聯(lián)重復(fù)序列。目前，W各種形式確認(rèn)并命名的Y-STR基 因座已有220多個(gè)，常用的Y-STR基因座有9個(gè)歐洲最小單倍型基因座，包括DYS19、DYS385a/ b、DYS389I/II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393 和 2 個(gè)美國 DNA 分析方法技術(shù)工作組 (Scientific Working Group on DNA Analysis Methods,簡稱SWGDAM)推薦的基因座，包 括DYS438、DYS439。將已發(fā)現(xiàn)的Y-STR遺傳標(biāo)記與A-STR遺傳標(biāo)記相比，大多數(shù)Y-STR遺傳標(biāo) 記具有復(fù)雜重復(fù)結(jié)構(gòu)，含有兩種或兩種W上的不同重復(fù)單位，群體中個(gè)體的核屯、重復(fù)序列 或重復(fù)次數(shù)不同，形成群體遺傳多態(tài)性。將Y-STR遺傳標(biāo)記的獨(dú)特性與STR分型檢測的優(yōu)越 性相結(jié)合，可應(yīng)用于個(gè)體識別、親子鑒定、家系排查及家譜構(gòu)建等。
[0004] 正如上述STR遺傳標(biāo)記及其檢測應(yīng)用的特點(diǎn)，眾多科研院所及試劑公司投入大量 人力物力對其進(jìn)行研究并開發(fā)可應(yīng)用于法醫(yī)物證的試劑盒產(chǎn)品，如目前國內(nèi)市場常見的 E邱ressmarker 20巧光檢測試劑盒、AGCU Database Y24巧光檢測試劑盒W及國外市場的 PowerPlex21System(PP21)和Powerinex Y23System(PPY23)，它們可W分別用于個(gè)體識別 檢測和父系檢測等。通常當(dāng)一個(gè)重大刑事案件發(fā)生時(shí)，法醫(yī)會先對現(xiàn)場提取的物證進(jìn)行A-STR檢測，當(dāng)確認(rèn)為男性犯罪嫌疑人遺留的物證時(shí)，再加做Y-STR檢測W增加偵查線索。然 而，因現(xiàn)有的STR分型技術(shù)受到檢材狀態(tài)、擴(kuò)增體系、檢測通量等因素的影響，兩次檢驗(yàn)程序 增加了檢測時(shí)間而往往延誤抓獲犯罪嫌疑人的最佳機(jī)會，同時(shí)由于犯罪嫌疑人遺留在現(xiàn)場 的物證量少導(dǎo)致檢測效能降低甚至失敗而不能幫助提供更多偵查線索?，F(xiàn)有檢測試劑盒已 無法很好的滿足公安實(shí)戰(zhàn)對于法醫(yī)DNA的快速檢驗(yàn)和現(xiàn)場檢驗(yàn)?zāi)芰Φ囊?，如何?shí)現(xiàn)A-STR 基因座和Y-STR基因座一起檢測，達(dá)到縮短檢測時(shí)間同時(shí)提高檢驗(yàn)效能成為有待解決的問 題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種人類基因組33個(gè)基因座的復(fù)合擴(kuò)增試劑盒。
[0006] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0007] -種人類基因組33個(gè)基因座的復(fù)合擴(kuò)增試劑盒，所述試劑盒含有用于特異性擴(kuò)增 33個(gè)基因座的33組引物對，33個(gè)基因座分別為D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、Penta E、DYS635、DYS456、TPOX、?〇l、D2S1338、CSFlPO、DYS385a/b、DYS458、DYS391、D19S433、vWA、 D21Sll、D18S51、D6S1043、Amelogenin、D8S1179、D5S818、D12S391、FGA、DYS438、DYS393、 DYS389I、DYS389II、DYS439、DYS392、Y_GATA_H4 及 DYS390，33 個(gè)基因座對應(yīng)的引物對如表1 所示：
[000引表1、各個(gè)基因座的引物序列及濃度
[00091
[r''i
[0012] 每個(gè)基因座中的至少一條引物的5'端標(biāo)記有巧光染料。
[0013] 優(yōu)選的，33個(gè)基因座的引物對使用5種不同的巧光染料標(biāo)記，根據(jù)標(biāo)記的巧光染料 不同分為5組，分別是：
[0014] 0351358、0135317、075820、0165539、？611化￡和0￥5635為第一組；
[0015] DYS456、TP0X、T冊 1、0251338、〔5尸1口0、0￥5385曰/6和0￥5458為第二組；
[0016] DYS391、D19S433、vWA、D21Sl 1、D18S51、D6S1043 為第 S組；
[0017] Amelogenin、D8S1179、D5S818、D12S391、FGA、DYS438為第四組；
[0018] 0￥5393、0￥53891、0￥538911、0￥5439、0￥5392、￥_6414_擬及0￥5390為第五組。
[0019] 所述5種不同的巧光染料分別是6-FAM、肥X、TAMRA、R0X和VIG。
[0020] 試劑盒內(nèi)還包括反應(yīng)緩沖液、熱啟動化q酶、超純水、AlIelic LadderW及巧光分 子量內(nèi)標(biāo)，所述反應(yīng)緩沖液為50ml的Tr i S-肥1、50mM的KCl、2. OmM的MgCl2、0.2mM的dNTPs和 0.8mg/mL的BSA。
[0021] 優(yōu)選的，試劑盒內(nèi)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的擴(kuò)增程序?yàn)?95°C2min;94°C30s，6rC40s，72 °[1111；[]1，重復(fù)15個(gè)循環(huán);90°[303,60°[1111；[]1，65°[803，重復(fù)15個(gè)循環(huán);60°[30111；[]1。
[0022] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述人類基因組33個(gè)基因座的復(fù)合擴(kuò)增試劑盒在 個(gè)體識別、親子鑒定、嫌疑人家系排查或常染色體數(shù)據(jù)庫及Y染色體數(shù)據(jù)庫中的的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明的有益效果是：
[0024] 1.本發(fā)明包含了公安部DNA數(shù)據(jù)庫推薦使用的18個(gè)A-STR基因座，同時(shí)涵蓋了 14個(gè) 突變率低、多態(tài)性高的Y-STR基因座，W及Amelogenin基因座，實(shí)現(xiàn)單管同時(shí)擴(kuò)增檢測33個(gè) 基因座，為業(yè)內(nèi)最多；
[0025] 2.本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了一次實(shí)驗(yàn)同時(shí)分析A-STR及Y-STR兩種數(shù)據(jù)，可同時(shí)用于案件的快 速排查，達(dá)到縮短檢測時(shí)間同時(shí)提高排除和確定犯罪嫌疑人的效率，14個(gè)Y-STR基因座對于 案件的排查具有很大的地域、姓氏指向性；
[0026] 3.本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了同建A-STR及Y-STR兩個(gè)DNA數(shù)據(jù)庫，大大節(jié)約了人力物力財(cái)力；
[0027] 4.本發(fā)明可W檢測出大量女性DNA樣本背景下的微量男性DNA，是如強(qiáng)奸犯罪等混 合斑檢測的有力武器；
[002引5.本發(fā)明在檢測父-子親子鑒定時(shí)，由于Y-STR數(shù)據(jù)已包含而無需單獨(dú)再做Y-STR 實(shí)驗(yàn)分析；
[0029] 6.本發(fā)明設(shè)及一種采用六色巧光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)系統(tǒng)對DNA樣品進(jìn)行分析的方 法;其中，本發(fā)明適用的DNA樣品來源于精斑、唾液斑、組織、毛囊、血痕或血液等；
[0030] 7.本發(fā)明試劑盒引物通過精屯、設(shè)計(jì)和不斷修改，具有較強(qiáng)的擴(kuò)增特異性及溫度耐 受性。
[0031] 綜上所述，本發(fā)明選擇了公安部DNA數(shù)據(jù)庫推薦的18個(gè)A-STR基因座和1個(gè)性別鑒 定基因座，并在此基礎(chǔ)上添加了 14個(gè)突變率低、多態(tài)性較高的Y-STR基因座，實(shí)現(xiàn)了 一次實(shí) 驗(yàn)同時(shí)對常染色體和Y染色體同步擴(kuò)增和檢測。本發(fā)明試劑盒可W對W濾紙和FTA卡為載體 的血斑和唾液斑進(jìn)行直接擴(kuò)增而無需模板提取和純化過程，也可W適用于不同提取方法提 取的DM樣品，屬于國內(nèi)、外獨(dú)家產(chǎn)品。本發(fā)明試劑盒可用于案件的快速排查，提高檢測效率 及案件排查速度，尤其對強(qiáng)奸案中男性樣本微量檢測及父-子親子鑒定檢測成效顯著，本試 劑盒適用范圍廣，兼容性好，與現(xiàn)有法醫(yī)DNA檢測系統(tǒng)完全兼容。
【附圖說明】
[0032] 圖1是某公安局提供的編號為9948的對照品的STR分型結(jié)果；
[0033] 圖2是等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物的電泳圖譜；
[0034] 圖3是對實(shí)際樣本檢測STR分型結(jié)果；
[0035] 圖4是對女性樣本進(jìn)行檢測時(shí)，DYS458基因座出現(xiàn)非特異擴(kuò)增的分型圖譜；
[0036] 圖5是對女性樣本進(jìn)行檢測時(shí)，DYS393基因座出現(xiàn)非特異擴(kuò)增的分型圖譜；
[0037] 圖6是對女性樣本進(jìn)行檢測時(shí)，DYS389Vn基因座出現(xiàn)非特異擴(kuò)增的分型圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面通過【具體實(shí)施方式】結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。但本領(lǐng)域技術(shù)人員 將會理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明 具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等 著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第=版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所 用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可W通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0039] 實(shí)施例1
[0040] 本發(fā)明所使用的33個(gè)基因座的相應(yīng)信息如下表2所示：
[0041] 表2、各基因座信息
[r - 一 一
[0044] 上述的基因座中，基因座名稱后標(biāo)記有a/b的為兩個(gè)基因座。
[0045] 檢測試劑盒的主要成分：
[0046] 33個(gè)基因座對應(yīng)的引物對如表3所示：
[0047] 表3、各個(gè)基因座的引物序列及濃度
[004只1
[i
[0051] 將所述33個(gè)基因座按如下分組并進(jìn)行巧光標(biāo)記：D3S1358、D13S317、D7S820、 D16S539、Penta E和DYS635為第一組，巧光染料標(biāo)記物為6-FAM;DYS456、TP0X、TH01、 D2S1338、CSFlP0、DYS385a/b 和 DYS458 為第二組，巧光染料標(biāo)記物為皿 X;DYS391、D19S433、 vWA、D21Sll、D18S51、D6S1043為第S組，巧光染料標(biāo)記物為TAMRA;Amelogenin、D8S1179、 D5S818、D12S391、FGA、DYS438為第四組，巧光染料標(biāo)記物為R0X;DYS393、DYS389I/II、 0￥5439、0￥5392邊4、0￥5390為第五組，巧光染料標(biāo)記物為￥16。
[0化2] PCR體系各組成如表4所示：