人乳頭瘤病毒58型單克隆抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及分子病毒學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及人乳頭瘤病毒58型 雜交瘤細(xì)胞系及其產(chǎn)生的單克隆抗體以及編碼它們的序列，和它們進(jìn)行診斷、預(yù)防和治療 的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 人乳頭瘤病毒(HPV)是無(wú)包膜的雙鏈小DNA病毒，主要侵及人的上皮組織，進(jìn)而誘 發(fā)各種良、惡性增生病變。高危型HPV感染與多種惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)，低危型的HPV感染則 弓丨起肛門(mén)和生殖疣。HPV感染的流行范圍廣，所引發(fā)的相關(guān)致死性的惡性腫瘤和多種性傳播 疾病對(duì)人類(lèi)健康具有嚴(yán)重的危害性，開(kāi)發(fā)安全有效的預(yù)防或治療性疫苗具有重大意義。
[0003] HPV病毒顆粒直徑為55~60nm，核衣殼呈20面體對(duì)稱(chēng)，由72個(gè)主要衣殼蛋白L1的五 聚體及次要衣殼蛋白L2組成。大量研究證實(shí)，HPV L1蛋白是HPV疫苗的主要靶蛋白。在多種 表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的HPV L1蛋白無(wú)需L2蛋白輔助即可形成在形態(tài)結(jié)構(gòu)與天然病毒顆粒相似 的類(lèi)病毒顆粒(Virus-LlkeParticle，VLP)。重組HPV L1-VLP疫苗已經(jīng)成功上市并用于預(yù)防 HPV感染及由此導(dǎo)致的宮頸癌、尖銳濕疣等疾病，并充分證明了 L1-VLP具有與野生同型病毒 相同的抗原性和免疫原性，其結(jié)構(gòu)與天然HPV高度相似，保留了天然病毒的絕大多數(shù)中和表 位，可誘導(dǎo)高滴度的中和抗體。
[0004] 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局（croA)在《預(yù)防用疫苗臨床前研究技術(shù)指導(dǎo)原則》中指 出："在生產(chǎn)工藝的各個(gè)環(huán)節(jié)和步驟中的產(chǎn)品均應(yīng)建立相應(yīng)的監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)，以便后續(xù)工藝的進(jìn) 行，保證產(chǎn)品的質(zhì)量、工藝的穩(wěn)定性"，同時(shí)要求"在半成品和成品階段的質(zhì)量控制至少包括 鑒別試驗(yàn)" 在HPV疫苗研發(fā)過(guò)程中，需要開(kāi)展四個(gè)方面的測(cè)定，即型別鑒定實(shí)驗(yàn)、抗原含量檢測(cè)和 體外效力測(cè)定。其方法均可以采用雙抗體夾心法ELISA。因此，在疫苗研究中，單克隆抗體是 疫苗抗原質(zhì)控的重要工具，尤其是具有特異性和中和活性的抗體在疫苗研發(fā)中具有不可替 代的作用。
[0005] 目前國(guó)外已上市的人乳頭瘤病毒疫苗主要有三種，分別是：2006年首次上市的由 16、18、6和11型人乳頭瘤病毒11重組蛋白構(gòu)成的四價(jià)疫苗(6 &"&811)，2007年首次上市的 由16和18型乳頭瘤病毒L1重組蛋白構(gòu)成的二價(jià)疫苗(Cervarix)，以及2014年12月首次上市 的由6、11、16、18、31、33、45、52和58型人乳頭瘤病毒11重組蛋白構(gòu)成的九價(jià)疫苗(6 &"&811 9)。本發(fā)明提供了最多可針對(duì)九價(jià)范圍內(nèi)HPV58的特異性和中和活性的單克隆抗體，利用其 中的兩株制備的ELISA檢測(cè)試劑盒，可以特異性地用于快速鑒別并定量HPV58 L1蛋白，可以 廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)和目前疫苗廠家生產(chǎn)疫苗過(guò)程中的質(zhì)檢，對(duì)女性的健康發(fā)展和公共衛(wèi) 生防控將具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供能夠識(shí)別HPV58的單克隆抗體以及產(chǎn)生該抗體的雜交 瘤細(xì)胞系。
[0007]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)HPV58的雙抗體夾心ELISA試劑盒。
[0008]本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供單克隆抗體的制備方法。
[0009] 本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供HPV的抗原檢測(cè)試劑盒的制備方法。
[0010] 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖峭ㄟ^(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 本發(fā)明提供的單克隆抗體，其是以HPV58 L1五聚體蛋白作為免疫原，制備獲得。具體地 說(shuō)是HPV58 L1五聚體蛋白作為免疫原免疫小鼠，采用雜交瘤技術(shù)經(jīng)過(guò)細(xì)胞融合并篩選得到 能持續(xù)、穩(wěn)定分泌抗HPV58 L1的雜交瘤細(xì)胞株，由各細(xì)胞株分泌得到單克隆抗體。
[0011] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中識(shí)別人乳頭瘤病毒58型L1蛋白的單克隆抗體，由雜交瘤 細(xì)胞株2F7產(chǎn)生，其保藏編號(hào):CGMCC No. 11295;分類(lèi)命名：雜交瘤細(xì)胞;保藏單位名稱(chēng)：中國(guó) 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心;保藏單位地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院 3號(hào);保藏日期：2015年10月30日。
[0012] 本發(fā)明公開(kāi)的單克隆抗體2F7,包含至少1個(gè)抗體重鏈可變區(qū)和至少1個(gè)抗體輕鏈 可變區(qū)，并且其中所述抗體輕鏈可變區(qū)具有⑶R序列⑶RL1、⑶RL2或/和⑶RL3，其中： CDRL1 包括SEQ ID N0:1; CDRL2包括SEQ ID N0:2; CDRL3包括SEQ ID N0:3。
[0013] 抗體重鏈可變區(qū)具有選自⑶RH1、⑶RH2或/和⑶RH3，其中： CDRH1 包括SEQ ID N0:4; CDRH2包括SEQ ID N0:5; CDRH3包括SEQ ID N0:6。
[0014] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中人乳頭瘤病毒58型LI蛋白的單克隆抗體或抗原結(jié)合片 段，包含至少1個(gè)抗體輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID N0:7和至少1個(gè)抗體重鏈可變區(qū)包括SEQ ID N0:8〇
[0015] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中本發(fā)明提供一種分離的核酸，該核酸編碼本發(fā)明抗體的 至少一個(gè)輕鏈可變區(qū)SEQ ID N0:7和重鏈可變區(qū)SEQ ID N0:8。
[0016] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中本發(fā)明提供一種核酸的表達(dá)載體，該載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞 時(shí)所述核酸與宿主細(xì)胞識(shí)別的控制序列有效連接。
[0017] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中本發(fā)明提供一種表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0018] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中本發(fā)明提供另一種人乳頭瘤病毒58型L1蛋白的單克隆 抗體，其特征在于該單克隆抗體由雜交瘤細(xì)胞株2G7產(chǎn)生，其保藏編號(hào):CGMCC No. 11296;分 類(lèi)命名：雜交瘤細(xì)胞;保藏單位名稱(chēng)：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心;保 藏單位地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào);保藏日期:2015年10月30日。
[0019] 由雜交瘤細(xì)胞株2G7產(chǎn)生的單克隆抗體，包含至少1個(gè)抗體重鏈可變區(qū)和至少1個(gè) 抗體輕鏈可變區(qū)，并且其中所述抗體輕鏈可變區(qū)具有⑶R序列⑶RL1XDRL2或/和⑶RL3,其 中： CDRL1 包括SEQ ID N0:9; CDRL2包括SEQ ID N0:10; CDRL3包括SEQ ID N0:11。
[0020] 由雜交瘤細(xì)胞株2G7產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)具有選自⑶RH1、⑶RH2或/和 CDRH3,其中： CDRH1 包括SEQ ID N0:12; CDRH2包括SEQ ID N0:13; CDRH3包括SEQ ID N0:14。
[0021] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中本發(fā)明提供一種識(shí)別人乳頭瘤病毒58型LI蛋白的單克 隆抗體或抗原結(jié)合片段，其特征在于其中包含至少1個(gè)抗體輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID N0:15 和至少1個(gè)抗體重鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO: 16。
[0022] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中本發(fā)明提供一種分離的核酸，其編碼本發(fā)明抗體的至少 一個(gè)輕鏈可變區(qū)SEQ ID N0:15和重鏈可變區(qū)SEQ ID N0:16。
[0023] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中本發(fā)明提供一種核酸的表達(dá)載體，其載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞 時(shí)所述核酸與宿主細(xì)胞識(shí)別的控制序列有效連接。
[0024] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中本發(fā)明提供一種包括表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0025]另一方面本發(fā)明提供一種檢測(cè)HPV58 L1的試劑盒，包括本發(fā)明公開(kāi)的單克隆抗體 或抗原結(jié)合片段。
[0026]本發(fā)明公開(kāi)的檢測(cè)HPV58 L1的試劑盒，還包括可檢測(cè)的標(biāo)記:放射性同位素、焚光 物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、有色物質(zhì)和/或酶。
[0027]另一方面本發(fā)明提供一種檢測(cè)一種特異性檢測(cè)人乳頭瘤病毒58型