一種右旋糖酐酶凍干粉的工業(yè)化生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種右旋糖酢酶凍干粉的工業(yè)化生產(chǎn)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 右旋糖酢酶是一種將右旋的高分子糖酢催化降解為低分子量多糖的酶。該酶及其 催化產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、化工等工業(yè)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值與廣泛的工業(yè)用途。如制藥行 業(yè)用右旋糖酢酶制備中、低、小分子量的右旋糖酢;制糖工業(yè)生產(chǎn)中用于提高收率及產(chǎn)品質(zhì) 量;用于離齒的防治及離齒疫苗的開發(fā);如食品添加劑行業(yè);如在人們使用的牙膏添加保護(hù) 牙齒等;酶催化反應(yīng)條件單一、溫和、能源消耗少等特點(diǎn)。
[0003] 眾多微生物如細(xì)麗毛殼、青酶、曲霉、鏈球菌、申克抱子絲菌、鑲刀霉菌、口腔擬桿 菌等都可產(chǎn)右旋糖酢酶。目前，商品化的右旋糖酶主要是從自然界中篩選自身產(chǎn)右旋糖酢 酶的細(xì)菌或真菌，進(jìn)而通過各種誘變方法選育高產(chǎn)右旋糖酢酶、性狀優(yōu)良的突變株。此外， 培育基因工程菌生產(chǎn)右旋糖酢酶也是極具發(fā)展前景的路線。相對國外而言，我國關(guān)于重組 右旋糖酢酶的研究較少。近年來，甲醇誘導(dǎo)型畢赤酵母工程菌產(chǎn)外源右旋糖酢酶是研究右 旋糖酢酶的重點(diǎn)。Roca等通過化發(fā)酵罐培養(yǎng)獲得了酶活為3000U/mL的右旋糖酢酶，化en等 用化發(fā)酵罐培養(yǎng)獲得了 83.9U/mL的酶活。然而，通過基因工程獲得的菌株，由于后期質(zhì)粒的 丟失，因此，菌株不穩(wěn)定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對上述問題，本發(fā)明提供了一種右旋糖酢酶凍干粉的工業(yè)化生產(chǎn)方法。本發(fā)明 右旋糖酢酶凍干粉的生產(chǎn)菌為化35-3,菌種從廣西北海甘薦田的±壤中分離獲得。所述菌 株化35-3的菌種保藏編號為CGMCC No. 11945;保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中屯、;保藏日期為2015年12月28日；保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3 號，分類命名為細(xì)麗毛殼化aetomi皿gracile。
[0005] -種右旋糖酢酶凍干粉的工業(yè)化生產(chǎn)方法，步驟如下：
[0006] (1)-代斜面的制備
[0007] 將菌株接種到一代斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行一代斜面培養(yǎng)，在28°C，濕度為40-60%的條 件下培養(yǎng)6-7天；
[000引（2)二代斜面的制備
[0009] 將一代斜面培養(yǎng)基上活化的菌株接種到二代斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行二代斜面培養(yǎng)，在 28°C，濕度為40-60%的條件下培養(yǎng)6-7天；
[0010] (3)種子培養(yǎng)
[0011] 將二代斜面培養(yǎng)的菌株制作菌懸液，按1.5-2% (體積比）的量接種入種子培養(yǎng)基 中，開啟攬拌轉(zhuǎn)速80轉(zhuǎn)/min、在27-29 °C條件下培養(yǎng)30-4化;種子培養(yǎng)30-4化時，pH為3.65-4.30,單位酶活為8-12u/mL，菌種的質(zhì)量濃度大于15%，總糖含量（質(zhì)量濃度）大于等于 0.15%。
[001^ (4)發(fā)酵培養(yǎng)
[0013]將種子液按1.5-2 % (體積比）的量接種入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在27-29°C，轉(zhuǎn)速為80轉(zhuǎn)/ min的條件下培養(yǎng)85-lOOh;培養(yǎng)過程中菌種的生長速率小于lOg/h。
[0014] 培養(yǎng)基
[0015] 一代斜面培養(yǎng)基:薦糖1.5g、馬鈴馨20g、瓊脂2g，加水定容至lOOmL。
[0016] 二代斜面培養(yǎng)基:薦糖1.5g、馬鈴馨20g、瓊脂2g，加水定容至lOOmL。
[0017] 種子培養(yǎng)基：酵母浸粉5-lOg/L，憐酸氨二鐘2-4g/L，硫酸儀0.2-0.5g/L，氯化鐘 0.1-0.3g/L，右旋糖酢大分子1000 10-15g/L，硫酸亞鐵0.005-0.0 lg/L，甜菜堿消沫劑 0.0 Ol-0.005g/L，憐酸氨二鋼0.005-0.0 lg/L，其余為自來水。
[0018] 發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母浸粉10-15g/L，憐酸氨二鐘2-4g/L，硫酸儀0.2-0.5g/L，氯化鐘 0.1-0.3g/L，右旋糖酢大分子1000 10-15g/L，硫酸亞鐵0.005-0.0 lg/L，甜菜堿消沫劑 0.0 l-0.05g/L，憐酸氨二鋼0.005-0.0 lg/L，其余為自來水。
[0019] 本發(fā)明中酵母浸粉購自安琪酵母股份有限公司，批號2014110603A9，F(xiàn)M902型酵母 浸粉。
[0020] (5)發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束，檢測發(fā)酵液的單位酶活，利用蒸汽通過盤管將發(fā)酵液加溫到 60°C，進(jìn)行滅活；
[0021] (6)經(jīng)過滅活的發(fā)酵液，通過0.5mm孔板過濾器;主要是去除發(fā)酵液中顆粒狀雜質(zhì) 或發(fā)酵過程中可能帶入的異物，過濾液進(jìn)入發(fā)酵液儲罐。
[0022] (7)發(fā)酵液經(jīng)過0.5mm孔板過濾器過濾后，再通過帶式過濾機(jī)，將95% W上的菌體 進(jìn)行截留。
[0023] (8)料液經(jīng)過帶式過濾機(jī)后送入超濾膜循環(huán)罐內(nèi)的物料通過膜的保安過濾器(主 要防止異物進(jìn)入膜系統(tǒng)，造成膜的損傷），進(jìn)入超濾膜，去除分子量大于200道爾頓的物質(zhì)， 接著清液進(jìn)入納濾膜儲罐。
[0024] (9)在納濾膜儲罐中料液通過膜的保安過濾器(主要防止異物進(jìn)入膜系統(tǒng)，造成膜 的損傷），進(jìn)入納濾膜去除分子量小于20道爾頓的物質(zhì)，物料進(jìn)入納濾液儲罐；
[0025] (10)在納濾液儲罐中的料液經(jīng)過0.45um液體過濾器、0.22um液體過濾器兩組除菌 過濾器進(jìn)行除菌過濾，料液進(jìn)入凍干機(jī)的凍干盤；
[0026] (11)用螺桿真空冷凍干燥機(jī)凍干機(jī)進(jìn)行凍干、升華干燥處理。
[0027] 凍干機(jī)裝入288個300mm X 300mm X 12mm的凍干盤;每個裝量的厚度為9.5 ± 0.5mm， 總裝量在24化；
[00%]凍干時的參數(shù)設(shè)定為：
[0029] 溫度降至負(fù)46°C時開始計(jì)算凍干時間，控制負(fù)47± TC維持15-16小時；結(jié)束后將 溫度升至負(fù)30.5±0.5°(：，維持150-180111111;再次將溫度升高到負(fù)20.5±0.5°(：，維持120-150min;后將溫度升至負(fù)10.5±0.5°C，維持120-150min;再次將溫度升高到負(fù)0.5 ±0.5°C， 維持120min;再次將溫度升高到9.5 ± 0.5°C，維持120-150min;再次將溫度升高到負(fù)19.5 ± 0.5°C，維持ISOmin;再次將溫度升高到負(fù)29.5±0.5°C，維持13-14小時;升華完畢停機(jī)出 料。
[0030] (12)收集的物料進(jìn)入500L無菌藥品混合機(jī)，開機(jī)120min進(jìn)行混合；
[0031] (13)用真空包裝機(jī)進(jìn)行包裝，得到右旋糖酢酶凍干粉。
[0032] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0033] 本發(fā)明菌株化35-3發(fā)酵過程中比較穩(wěn)定，產(chǎn)酶快，且制備的右旋糖酢酶活力高。本 發(fā)明中右旋糖酢酶的酶活總收率達(dá)到80-83%之間，凍干粉的酶活單位大約在10萬-15萬 之間，實(shí)現(xiàn)了右旋糖酢酶大工業(yè)化的生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0034] 圖1是批號為20150505的凍干粉的檢驗(yàn)報(bào)告書；
[0035] 圖2是批號為20150506的凍干粉的檢驗(yàn)報(bào)告書；
[0036] 圖3是批號為20150703的凍干粉的檢驗(yàn)報(bào)告書。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而 更為清楚。但實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng) 該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可W對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修 改或替換，但運(yùn)些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0038] 本發(fā)明生產(chǎn)菌為化35-3,菌種保藏編號為CGMCC No. 11945;保藏單位為中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、;保藏日期為2015年12月28日；保藏地址為北京市 朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
[0039] 將本發(fā)明生產(chǎn)菌，進(jìn)行一、二代斜面培養(yǎng)后，進(jìn)行下一步培養(yǎng)。
[0040] 實(shí)施例1利用本發(fā)明生產(chǎn)菌GL35-3進(jìn)行發(fā)酵制備右旋糖酢酶
[0041 ] (1)種子培養(yǎng)(流水號201-20150505):按照消后45化配料
[0042]
[0043] 用飽和蒸汽進(jìn)行消毒，滅菌后體積44化，降溫到28°C，按2% (體積比）接入二代斜 面培養(yǎng)后懸浮液，開啟攬拌轉(zhuǎn)速80轉(zhuǎn)/min、27°C-29°C條件進(jìn)行下，培養(yǎng)至40h;檢測種子