恒定鏈經修飾的雙特異性五價和六價Ig-M抗體的制作方法
【專利說明】恒定鏈經修飾的雙特異性五價和六價I g-M抗體 發(fā)明領域
[0001 ]本發(fā)明設及具有五聚或六聚結構的結合分子。
[0002] 具體來說，本發(fā)明設及具有五聚或六聚環(huán)結構的結合分子，其包含五個或六個雙 特異性結合單元。在本發(fā)明結合分子中，所述雙特異性結合單元各自結合兩個不同結合祀 標或相同結合祀標上的不同結合區(qū)（例如表位），并且所述五個或六個雙特異性結合單元各 自具有相同結合特異性(結合至相同的兩個結合祀標）。在具體實施方案中，本發(fā)明設及具 有五聚或六聚結構的雙特異性抗體，其包含五個或六個雙特異性結合單元。
[0003] 在不同方面中，本發(fā)明包括包含五個或六個單特異性結合單元的結合分子，其中 (i)所述單特異性結合單元各自包含兩個IgM重鏈恒定區(qū)，所述兩個IgM重鏈恒定區(qū)各自至 少包含綴合至結合祀標的結合區(qū)的化3和化4域，（ii)至少兩個所述單特異性結合單元結合 至不同結合祀標。本發(fā)明還包括包含五個或六個雙特異性結合單元的結合分子，其中（i)所 述雙特異性結合單元各自包含兩個IgM重鏈恒定區(qū)，所述兩個IgM重鏈恒定區(qū)各自至少包含 綴合至結合祀標的結合區(qū)的化3和化4域，并且（i i)至少兩個所述雙特異性結合單元結合至 不同結合祀標。在具體實施方案中，所述結合分子是多特異性IgM抗體。
【背景技術】
[0004] 由于人源化抗體的出現(xiàn)，諸如民ituxan? (利妥昔單抗（r i tuximab))、Here巧tin? (曲妥珠單抗（trastuzumab))和AvasUn及（貝伐單抗(bevacizumab))的抗體的治療用途已 使醫(yī)學領域發(fā)生巨大變化，包括腫瘤學、炎癥性病癥(諸如類風濕性關節(jié)炎）的治療和許多 其他適應癥。在美國，超過30種人類或人源化抗體已批準用于臨床用途，并且超過600種新 抗體或抗體樣分子處于發(fā)展的不同階段。一些抗體對諸如血管內皮生長因子(VEGF)或腫瘤 壞死因子(TNF)的可溶性祀標分子具有括抗功能，它們的作用是疾病的病理性過程的一部 分。或者，抗體可結合、阻斷和/或誘導諸如癌癥的某些疾病中病理性細胞的破壞。運些治療 性抗體的主要功能是通過化b區(qū)的結合和經由化域的效應子功能的募集(運也介導抗體的 長循環(huán)半衰期）?？贵w相較于小分子藥物的主要優(yōu)點之一可在于它們的強烈的特異性?？贵w 可非常準確地祀向選擇的蛋白抗原(諸如癌基因），排除非常相似的同源物，從而允許良性 的安全特性。因此，良好地表征抗體的特異性單一祀向功能。
[0005] 隨著領域的進步，抗體功能已得到增強，其通過蛋白質工程的創(chuàng)造性手段諸如提 供較高的親和力、較長的半衰期和/或較好的組織分布，W及組合小分子和大分子技術來實 現(xiàn)對經由毒性有效載荷遞送破壞細胞的提高的關注(例如抗體-藥物綴合物）。改良抗體功 能的另一種方法利用免疫球蛋白G(IgG)結構的二價結合，從而允許一個IgG分子結合兩個 抗原。事實上，在某些應用中存在不對稱抗體通過同時結合兩個不同祀標抗原來發(fā)揮有用 功能的良好可能性。為了解決運種需要，已產生多種構建體W得到可結合兩個不同抗原的 單一分子，從而允許之前從未在自然界中見到的功能。運種雙特異性方法的實例是結合分 別在T細胞和B細胞上的CD3和CD19受體的"布利莫單抗(blinatumumabr (MT103)。細胞毒性 T細胞對癌性B細胞的運種束縛允許有效治療B細胞白血病。
[0006] 但是，在雙特異性抗體的構建、表達和產生中仍然存在相當大的技術難度。盡管雙 特異性抗體由于它們同時結合兩個不同抗原的能力而被視為有前景的治療劑，但是它們的 實用性由于穩(wěn)定性和制造復雜性的問題受到限制。
[0007] 各種形式的蛋白質工程改造已用于匹配異源重鏈，加上重鏈和輕鏈的適當成對匹 配，W有效得到雙特異性IgG。此外，各種雙特異性抗體型式，包括四價體瘤、化學異綴合物、 使用選擇的異二聚化域的重組構建體和由兩種最小抗原結合位點組成的最小大小的重組 構建體。
[000引但是，所有運些努力都存在困難。
[0009] 因此，除了針對開發(fā)雙特異性治療性抗體的努力，仍然存在對開發(fā)可引起更有效 并靈活地產生雙特異性和多特異性抗體的更有效平臺的極大需要，從而使此類治療劑的發(fā) 現(xiàn)與臨床引入之間的時間線變短并且實現(xiàn)具有多種特異性和/或化合價的新類型抗體型式 的設計和產生。

【發(fā)明內容】

[0010] 本發(fā)明設及具有五聚或六聚環(huán)結構的結合分子，諸如像具有五個或六個雙特異性 結合單元的分離的IgM抗體，W及用于制備和使用所述結合分子的方法和方式。
[0011] 在一個方面中，本發(fā)明設及一種具有五聚或六聚環(huán)結構的結合分子，其包含五個 或六個雙特異性結合單元，其中所述雙特異性結合單元各自具有相同的兩種結合特異性并 且包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈至少包含與第一結合祀標的第一結合區(qū)綴合的IgM重 鏈恒定區(qū)的化4域，所述第二鏈至少包含IgM重鏈恒定區(qū)的化4域和第二結合祀標的第二結 合區(qū)，其中所述第一結合祀標和所述第二結合祀標不同，并且其中所述第一鏈和所述第二 鏈經過組裝W由于它們個別IgM重鏈恒定區(qū)之間所產生的不對稱界面而產生雙特異性結合 單元。
[0012] 在一個實施方案中，所述雙特異性結合單元是相同的。
[0013] 在另一實施方案中，所述結合分子還包含IgM J鏈。
[0014] 在又另一實施方案中，所述結合分子具有五聚環(huán)結構。
[0015] 在另一實施方案中，所述結合分子具有六聚環(huán)結構。
[0016] 在又另一實施方案中，在所述結合分子中，所述第一鏈和所述第二鏈還包含IgM重 鏈恒定區(qū)的化3域。
[0017] 在另一實施方案中，所述第一鏈和所述第二鏈還包含IgM重鏈恒定區(qū)的化2域。
[0018] 在其他實施方案中，所述第一結合祀標和所述第二結合祀標選自膚、多膚、糖蛋 白、核酸分子W及有機小分子和非有機小分子，包括但不限于可溶性多膚、細胞表面受體、 配體、分子轉運蛋白、酶和酶底物。
[0019] 在又另一實施方案中，所述第一結合祀標和所述第二結合祀標是相同可溶性祀標 上的兩個位點、相同細胞表面受體祀標上的兩個位點、兩個不同可溶性祀標、兩個細胞表面 受體祀標、一個可溶性祀標和一個細胞表面受體祀標、一個可溶性祀標或細胞表面受體祀 標和一個長停留時間祀標、一個可溶性祀標和一個基質蛋白祀標或底物祀標、一個可溶性 祀標或受體祀標和一個分子轉運蛋白祀標，或兩個不同細胞類型。
[0020] 將結合區(qū)綴合至分子的其余部分可采取融合。因此，例如，第一結合區(qū)和第二結合 區(qū)可分別融合至第一 IgM重鏈恒定區(qū)和第二IgM重鏈恒定區(qū)的N末端。
[0021] 在具體實施方案中，所述第一結合區(qū)和所述第二結合區(qū)是抗體的可變區(qū)。
[0022] 在另一實施方案中，所述第一結合祀標和所述第二結合祀標是兩個不同抗原。
[0023] 在又另一實施方案中，所述第一結合祀標和所述第二結合祀標是相同抗原上的不 同表位。
[0024] 在另外實施方案中，所述第一結合區(qū)和所述第二結合區(qū)可W是結合至兩個結合祀 標或相同結合祀標上的不同表位的兩個不同抗體重鏈可變區(qū)。
[0025] 在本發(fā)明結合分子中，抗體重鏈可變區(qū)可來自IgG、IgA、I巧和/或IgM抗體，優(yōu)選來 自IgM抗體。優(yōu)選地，本文結合分子是雙特異性IgM分子，所述分子可(但不需要)還包含與兩 個不同IgM重鏈可變區(qū)中的一個締合的至少一個IgM輕鏈可變區(qū)序列。
[0026] 在具體實施方案中，在本發(fā)明結合分子中，在結合單元的兩條鏈的IgM重鏈恒定區(qū) 之間，至少一些不對稱界面由鹽橋產生，所述鹽橋由所述結合單元的兩條鏈的化2、化3和/ 或化4域中的至少一個中帶相反電荷的氨基酸殘基之間的成對開關形成。
[0027] 因此，鹽橋可在結合單元的兩條鏈的化2-化2、化4-化4和化2-化3-化4域中的至少 一個之間形成。
[002引在一個實施方案中，成對開關選自由W下組成的組:E一K、K一E; R一E、E一R; D一K、 K一D;和R一D、D一R。
[0029] 在另一實施方案中，結合分子可包含化4-化4域中的至少一個帶成對電荷的氨基 酸殘基開關，其中開關可例如選自由W下組成的組：R328E，DwE339R，K; R34化，DwS330R，K;1。7化，D^^E3S5R，K.; R427E，D<-->E339民，K;和]-'354E，D<-->I397R.1C。
[0030] 在另一實施方案中，化2-化2域之間的至少一個帶成對電荷的氨基酸開關并且可 例如選自由E167R，!<^K177E，D和K16化、D一EI70民，K組成的組。
[0031] 在又另一實施方案中，至少一個帶成對電荷的氨基酸殘基開關在化2-化3-化4域 中，并且可例如選自由W下組成的組：DO化，Rw投1姐玉;K150E,D一E385K，民;和 技1縣0玉wD3鄉(xiāng)民氏。
[0032] 在另一實施方案中，在本發(fā)明結合分子中，在結合單元的兩條鏈的IgM重鏈恒定區(qū) 之間，至少一些不對稱界面通過鈕-孔化nobs-into-holes)連接產生，所述鈕-孔連接可例 如通過選自由W下組成的組的突變產生:鈕:T350一Y，F(xiàn)，W;和冊95一Y，F(xiàn);和孔:L352一G，A， ￥，1，]?，5，1';冊95一4，￥，1，1^，]\1，尸，￥;尸393一胖，￥;1397一4，￥，5，1';1350一5,4，￥;和1348一5。
[0033] 在特定實施方案中，在本發(fā)明結合分子中，輕鏈可變區(qū)序列（若存在)通過在輕鏈 與重鏈之間產生不對稱界面來偶聯(lián)至它們的匹配重鏈可變區(qū)。
[0034] 在其他實施方案中，不對稱界面通過CrossMab技術、鈕-孔偶聯(lián)和/或鹽橋偶聯(lián)來 產生。
[0035] 本發(fā)明結合分子可包含共同輕鏈和/或可綴合至毒素或化療劑。優(yōu)選地，綴合是通 過融合，但通過化學連接子的綴合也包括在本發(fā)明范圍內。
[0036] 本文結合分子可W是具有五聚或六聚結構的雙特異性抗體，所述抗體可W是嵌合 的或人源化的。
[0037] 在不同方面中，本發(fā)明設及一種組合物，其包含至少約70%、或至少80%、或至少 90%或至少95%、至少98%、或至少99%如上文中定義的結合分子。
[0038] 在具體實施方案中，組合物是藥物組合物。
[0039] 本發(fā)明進一步設及一種具有五聚或六聚環(huán)結構的多特異性結合分子，其包含五個 或六個單特異性結合單元，其中（i )所述單特異性結合單元各自包含兩個IgM重鏈恒定區(qū)， 其各自至少包含綴合至結合祀標的結合區(qū)的化3和化4域，（ii)至少兩個所述單特異性結合 單元結合至不同結合祀標，并且（iii)外部不對稱界面在結合至不同結合祀標的鄰近單特 異性結合單元的重鏈恒定區(qū)之間產生。
[0040] 在一個實施方案中，至少=個所述單特異性結合單元結合至不同結合祀標。
[0041] 在另一實施方案中，至少四個所述單特異性結合單元結合至不同結合祀標。
[0042] 在又另一實施方案中，結合分子具有五聚環(huán)結構并且所有五個單特異性結合單元 結合至不同祀標。
[0043] 在另一實施方案中，結合分子具有六聚環(huán)結構并且至少五個所述單特異性結合單 元結合至不同祀標。
[0044] 在又另一實施方案中，所有六個單特異性結合單元結合至不同祀標。
[0045] 在另一方面中，本發(fā)明設及一種具有五聚或六聚環(huán)結構的多特異性結合分子，其 包含五個或六個雙特異性結合單元，其中（i)所述雙特異性結合單元各自包含兩個IgM重鏈 恒定區(qū)，其各自至少包含綴合至結合祀標的結合區(qū)的化3和化4域，（ii)至少兩個雙特異性 結合單元結合至不同結合祀標，（i i i)內部不對稱界面在各雙特異性結合單元的兩個IgM重 鏈恒定區(qū)之間產生，并且（iv)外部不對稱界面在結合至不同祀標的鄰近雙特異性結合單元 的重鏈恒定區(qū)之間產生。
[0046] 在一個實施方案中，至少=個所述雙特異性結合單元結合至不同結合祀標。
[0047] 在另一實施方案中，至少四個所述雙特異性結合單元結合至不同結合祀標。
[0048] 在又另一實施方案中，結合分子具有五聚環(huán)結構并且所有五個雙特異性結合單元 結合至不同祀標。
[0049] 在另一實施方案中，結合分子具有六聚環(huán)結構并且至少五個所述雙特異性結合單 元結合至不同祀標。
[0050] 在又另一實施方案中，所有六個雙特異性結合單元結合至不同祀標。
[0051] 在不同實施方案中，多特異性結合分子還包含IgM J鏈。
[0052] 在各種實施方案中，多特異性結合分子可具有五聚或六聚環(huán)結構。
[0053] 不管本發(fā)明多特異性結合分子的結合特異性的數(shù)目和性質，W下特定實施方案適 用：
[0054] 在一個實施方案中，在至少一個結合單元中，IgM重鏈恒定區(qū)還包含化2域。在又另 一實施方案中，在所有結合單元中，IgM重鏈恒定區(qū)還包含化2域。在各種實施方案中，本發(fā) 明多特異性結合分子可結合至選自W下的結合祀標:膚、多膚、糖蛋白、核酸分子W及有機 小分子和無機小分子。
[0055] 在其他實施方案中，本發(fā)明多特異性結合分子結合至選自W下的結合祀標:可溶 性多膚、細胞表面受體、配體、分子轉運蛋白、酶和酶底物。
[0056] 在另外實施方案中，結合至不同祀標的本發(fā)明多特異性結合分子選自由結合至W 下的結合單元組成的組:相同可溶性祀標上的位點；相同細胞表面受體祀標上的位點；不同 可溶性祀標;不同細胞表面受體祀標;可溶性祀標和細胞表面受體祀標;可溶性祀標或細胞 表面受體祀標和長停留時間祀標;可溶性祀標和基質蛋白祀標或底物祀標;可溶性祀標或 受體祀標和分子轉運蛋白祀標，和不同細胞類型。
[0057] 在具體實施方案中，在本發(fā)明結合分子內的結合單元中，IgM重鏈恒定區(qū)與結合祀 標的結合區(qū)之間的綴合是通過融合。因此，例如，結合區(qū)可融合至IgM重鏈恒定區(qū)的N末端。
[0058] 在一個實施方案中，至少一個結合區(qū)是抗體的可變區(qū)。
[0059] 在另一實施方案中，所有結合區(qū)是抗體重鏈可變區(qū)。
[0060] 在又另一實施方案中，至少兩個結合祀標是不同抗原。
[0061] 在又另一實施方案中，至少兩個結合祀標是相同抗原上的不同表位。
[0062] 在所有方面和實施方案中，抗體重鏈可變區(qū)可來自IgG、IgA、I姐或IgM抗體，優(yōu)選 來自IgM抗體。
[0063] 在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明多特異性結合分子是多特異性IgM抗體。
[0064] 在一個實施方案中，本發(fā)明多特異性IgM抗體還包含與至少一個結合單元中的IgM 重鏈可變區(qū)締合的至少一個IgM輕鏈可變區(qū)序列。
[0065] 在另一實施方案中，多特異性IgM抗體還包含與IgM重鏈可變區(qū)中的每一個締合的 IgM輕鏈可變區(qū)序列。
[0066] 在所有方面和實施方案中，外部不對稱界面通過化3域內的變化產生。在一個實施 方案中，變化由鹽橋產生，所述鹽橋由化3域中帶相反電荷的氨基酸殘基之間的成對開關形 成。
[0067] 在各種實施方案中，提供外部不對稱界面的鹽橋由化3-化3域中至少一個帶成對 電荷的氨基酸殘基開關形成，所述氨基酸殘基開關可例如是鄰近y鏈中的1C238 D293或 K268 <-? D294.
[0068] 在所有方面和實施方案中，在本發(fā)明多特異性結合分子(例如多特異性IgM抗體） 中，內部不對稱界面由鹽橋產生，所述鹽橋由化2、化3和/或化4域中的至少一個中帶相反電 荷的氨基酸殘基之間的成對開關形成。
[0069] 在一個實施方案中，鹽橋在所述結合單元的兩條鏈的化2-化2、化4-化4和化2-化 3-化4域中的至少一個之間形成。
[0070] 在另一實施方案中，成對開關選自由W下組成的組:E一K、K一E; R一E、E一R; D一K、 K一D;和R一D、D一R。
[0071] 在另一實施方案中，多特異性結合分子，例如多特異性IgM抗體，包含化4-化4域中 至少一個帶成對電荷的氨基酸殘基開關，所述開關可例如選自由W下組成的組： R32化，DwE339R乂； RM化，[>-*S330民，K; K巧化，DwE385R,K;及427E，D一E339R，K;和 T354E,Dwl397R,K，
[0072] 在又另一實施方案中，多特異性結合分子，例如多特異性IgM抗體，包含化2-化2域 之間至少一個帶成對電荷的氨基酸開關，所述開關可例如選自由E167氏區(qū)一財77E，D和 區(qū)1貓E，r)4；E巧腿糸組成的組。
[0073] 在另一實施方案中，多特異性結合分子，例如多特異性IgM抗體，包含化2-化3-化4 域中至少一個帶成對電荷的氨基酸殘基開關，所述開關可例如選自由W下組成的組： D1211<，民<一1<3 i 5D，E ; K150E，D一E;;85K，R;和 K185D，E一D360K，R。
[0074] 在所有方面和實施方案中，IgM重鏈恒定區(qū)之間的至少一些外部不對稱界面和/或 內部不對稱界面可通過鈕-孔連接產生。例如，至少一個鈕-孔連接由選自由W下組成的組 的突變產生:鈕:T350一Y，F(xiàn)，W;和冊95一 Y，F(xiàn);和孔:L352一 G，A，V，I，M，S，T;H395^A，V，I，L, M，F(xiàn)，Y;F393一W，Y;I397一A，V，S，T;T350一S，A，V;和T348一S。
[0075] 在包含輕鏈可變區(qū)序列的多特異性IgM抗體中，此類輕鏈可變區(qū)序列可通過在輕 鏈與重鏈之間產生不對稱界面來偶聯(lián)至它們的匹配重鏈可變區(qū)。在各種實施方案中，不對 稱界面可通過CrossMab技術、鈕-孔偶聯(lián)和/或鹽橋偶聯(lián)來產生。在另一實施方案中，多特異 性結合分子的結合單元包含共同輕鏈。
[0076] 在所有方面和實施方案中，多特異性結合分子可綴合至毒素或化療劑，其中綴合 可例如通過融合和/或通過化學連接子。
[0077] 本發(fā)明多特異性IgM抗體可W是嵌合的或人源化的。
[0078] 在另一方面中，本發(fā)明設及一種組合物，其包含至少約70%、或至少約80%、或至 少約90%、或至少約95%、或至少約98%、或至少約99%本文的多特異性結合分子。所述組 合物可例如是包含至少一種藥學上可接受的成分的藥物組合物。
【附圖說明】
[0079] 圖1說明包含J鏈的IgM五聚體的結構，其中鏈A和B在天然IgM中是相同的。
[0080] 圖2A說明具有兩種結合特異性的五元IgM分子，其中指定為A和B的重(ii)鏈是不同 的。
[0081] 圖2B說明包含五個或六個單特異性結合單元的多特異性IgM抗體，其中（i)單特異 性結合單元各自包含兩個IgM重鏈恒定區(qū)，所述兩個IgM重鏈恒定區(qū)各自至少包含綴合至結 合祀標的結合區(qū)的化4域，（i i)至少兩個單特異性結合單元結合至不同結合祀標。
[0082] 圖2C說明包含五個或六個雙特異性結合單元的多特異性IgM抗體，其中（i)雙特異 性結合單元各自包含兩個IgM重鏈恒定區(qū)，所述兩個IgM重鏈恒定區(qū)各自至少包含綴合至結 合祀標的結合區(qū)的化4域，并且（ii)至少兩個雙特異性結合單元結合至不同結合祀標。
[0083] 圖3為如Czajkowsky D.M，化曰〇 Z,PNAS 2009; 106:14960-14965中公開的IgM分子 的A重鏈和B重鏈的結構模型。
[0084] 圖4A示出人類IgGU I巧和IgM的分別CGUCEl和CMl恒定域的比對。
[0085] 圖4B示出人類I巧和I gM的分別CE2和CM2恒定域的比對。
[0086] 圖4C示出人類IgGU I巧和IgM的分別CG2、CE3和CM3恒定域的比對。
[0087] 圖4D示出人類IgG、I巧和IgM的分別CG3、CE4和CM4恒定域的比對。
[008引在圖4A至4D中：
[0089] 人類I巧序列來自GenBank J00222.1;殘基編號來自PDB 2WQR;螺旋化)和折疊（S) 分配來自PDB