白介素-2融合蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及白介素-2融合蛋白。更具體地說，本發(fā)明部分地提供了包含結(jié)合至 Bcl-2家族成員蛋白部分的白介素-2蛋白部分的融合蛋白。
【背景技術(shù)】
[0002] 白介素-2(化-2)是主要由激活CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的多效性細(xì)胞因子，其在產(chǎn)生正常 免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵的作用?；?2促進(jìn)激活T淋己細(xì)胞的增殖和擴(kuò)大培養(yǎng)、增強(qiáng)B細(xì)胞生長、 并且激活單核細(xì)胞和天然殺手細(xì)胞。
[0003] IL-2是協(xié)同表達(dá)的IL-2受體a (IL-2Ra或者CD25 ;也稱為"Tac"抗原）、IL-2受體0 (比-2祕或者CD122) W及白介素-2受體丫（比-2R 丫或者CD132;共有丫鏈）的配體。
[0004] 比-2Ra W約IQ-8M的Kd與化-2結(jié)合，并且也稱為"低親和力"的比-2受體；化-2與僅 表達(dá)IL-2Ra的細(xì)胞的結(jié)合沒有導(dǎo)致任何可檢測的生物學(xué)反應(yīng)。
[0005] 大多數(shù)細(xì)胞例如靜息T細(xì)胞對IL-2是不敏感的，因?yàn)樗鼈儍H表達(dá)IL-2郎和IL-2R 丫?？乖荏w介導(dǎo)T細(xì)胞激活后，化-2Ra迅速表達(dá)。一旦IL-2Ra結(jié)合IL-2,其然后依次與IL-2祕和IL-2R 丫配合，導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和IL-2介導(dǎo)的生長刺激。
[0006] 重組人化-2( Proleukin形，阿地白介素）被允許當(dāng)作免疫療法來治療轉(zhuǎn)移性黑色 素瘤和轉(zhuǎn)移性腎癌。Proleukin液被用于治療癌癥已超過15年，并且已經(jīng)表明在患有轉(zhuǎn)移性 黑色素瘤或者腎癌的患者中具有約15 %的完全或者部分反應(yīng)比例。但是，Prole址in造成引 起肺部水腫和肝損傷的副作用。
[0007] Ontak飯（地尼白介素 (deniIeukin diftitox))是一種由作為勒!向配體的IL-2和 作為細(xì)胞殺滅載荷的修飾細(xì)菌毒素組成的融合蛋白，在美國被允許用于治療皮膚T細(xì)胞淋 己瘤(CTCL)。盡管化tak被廣泛認(rèn)為是治療CT化的有效藥物，但是其具有重大的安全問題， 導(dǎo)致在美國的使用受到限制并且在美國之外沒有得到許可。由于其在1999允許用于CT化， 在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、肺癌和其他適應(yīng)癥中的試驗(yàn)已經(jīng)表明化tak具有鼓舞人屯、的有 效跡象，但是因?yàn)閲?yán)重的毒副作用的緣故而已經(jīng)被放棄。因此，使用IL-2作為抗腫瘤劑已經(jīng) 受到伴隨用于腫瘤反應(yīng)所需劑量的嚴(yán)重毒性的限制。
[000引環(huán)狀排列山;[1^111曰1'17 permuted)的分子是線性分子(例如配體）的末端已經(jīng)直接 或者經(jīng)由接頭連接在一起從而產(chǎn)生環(huán)狀分子的那些分子，此后所述環(huán)狀分子在另一個(gè)位置 打開從而產(chǎn)生新的帶有不同于原先分子的末端的末端的線性分子?；?2的環(huán)狀排列變體已 經(jīng)在例如于2000年1月4日授權(quán)給化Stan等的美國專利No. 6，Ol 1，002中有描述。
[0009] 程序化細(xì)胞死亡或者"調(diào)亡"是一種在動(dòng)物細(xì)胞發(fā)育中常見的現(xiàn)象，并且受到主動(dòng) 調(diào)節(jié)和被動(dòng)調(diào)節(jié)運(yùn)兩者調(diào)節(jié)。除了其參與淋己樣系統(tǒng)發(fā)育和整個(gè)細(xì)胞群穩(wěn)態(tài)之外，調(diào)亡還 在由調(diào)亡途徑的異常調(diào)節(jié)引起的各種疾病和損傷中發(fā)揮重要的作用。相反，調(diào)亡的異常抑 制能夠?qū)е录?xì)胞的過度增殖，從而導(dǎo)致癌癥和其他的過度增殖性素亂。
[0010] 調(diào)亡受到很多蛋白的調(diào)節(jié)，運(yùn)些蛋白包括Bcl-2家族的成員。Bcl-2是被鑒定為調(diào) 節(jié)調(diào)亡的第一批蛋白之一（Cle ary 等，Cell 47:19-28，1986;Tsuji mo to 和 Croce, Proc.化tl .Acad. Sci .USA 83:5214-5218，1986)。由于它的發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)有若干個(gè)Bcl-2相關(guān) 蛋白（"8(：1-2家族蛋白"或者"8(31-2家族成員"）被鑒定為調(diào)亡的調(diào)節(jié)因子(胖11；[16,66]163 Dev. 10:1-15，1996;化ng等，細(xì)胞80:285-291，1995)。
[0011] 已經(jīng)探索了用于治療癌癥等的若干種治療性試劑，但是運(yùn)些治療性試劑表現(xiàn)出限 制了它們在臨床中的應(yīng)用的多種局限性。例如，很多化學(xué)治療性試劑通過誘導(dǎo)正在增殖的 寶生性細(xì)胞中的調(diào)亡來發(fā)揮作用，但是它們的治療價(jià)值受到它們對正常細(xì)胞具有毒性的程 度的限制。使用標(biāo)準(zhǔn)調(diào)亡抑制性分子例如膚類半脫氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspases)抑制劑 (例如DEVD類)進(jìn)行的治療已經(jīng)證明由于運(yùn)些抑制劑具有低的膜滲透性而無法滿意地用于 臨床工作。
[0012] 已經(jīng)提出祀向免疫毒素(在有毒分子例如細(xì)菌毒素和通常衍生自抗體分子的祀向 域之間的遺傳融合或者生物化學(xué)融合）W嘗試選擇性地消除癌癥分子。例如，已經(jīng)生成白喉 毒素(DT)變體并且測試了它們選擇性地殺滅癌癥細(xì)胞的能力(Tho巧e等，^^re 271:752-755，1978;Laske等，化Uire Medicine 3:1362-1368，1997)。類似地，已經(jīng)研究了假單胞菌 (Pseudomonas)外毒素（PE)融合蛋白作為潛在的癌癥療法化reitman和化Stan,Blood 90: 252-259，1997; Shimamura等Cancer Res. 67:9903-9912; 2007)。已經(jīng)在各種細(xì)胞類型中測 試了DT-BclxL融合蛋白阻斷由星形抱菌素(S化urosporin)、丫射線福射和脊髓灰質(zhì)炎病毒 誘導(dǎo)的調(diào)亡的能力(Youle等，Proc化tl Acad Sci.96:9563-9567)。粒細(xì)胞-巨隧細(xì)胞菌落 刺激因子BclxL(GM-CSF-BclxL)融合蛋白已經(jīng)顯示出加強(qiáng)人類單核細(xì)胞的增殖，并且保護(hù) 細(xì)胞W防發(fā)生誘導(dǎo)性細(xì)胞死亡(Youle等，JBC 282(15): 11246-11254)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明設(shè)及白介素-2融合蛋白。更具體地說，本發(fā)明部分地提供了包含結(jié)合至 Bcl-2家族成員蛋白部分的白介素-2蛋白部分的融合蛋白及其應(yīng)用。
[0014] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白包含白介素-2(化-2)和 Bcl-2家族多膚。在一些實(shí)施方式中，所述Bcl-2家族多膚可W是包含BH3域的促調(diào)亡Bcl-2 家族多膚（例如BacUBik/師4、81(1、81111/8〇(1、化4、834或者83^)。所述肌3域可^進(jìn)一步包含 降低憐酸化的突變。包含進(jìn)一步包含降低憐酸化的突變的BH3域的所述促調(diào)亡Bcl-2家族多 膚是Bad多膚。所述融合蛋白可能能夠促進(jìn)表達(dá)IL-2R的祀細(xì)胞的細(xì)胞死亡或者調(diào)亡、抑制 細(xì)胞存活、或者抑制細(xì)胞增殖。
[0015] 在一些實(shí)施方式中，所述Bcl-2家族多膚可W是抗調(diào)亡Bcl-2家族多膚（例如Bcl-Xl、Bc1-w或者Bcl-2)。所述融合蛋白可能能夠抑制表達(dá)化-2R的祀細(xì)胞的細(xì)胞死亡和調(diào)亡、 促進(jìn)細(xì)胞存活、或者促進(jìn)細(xì)胞增殖。
[0016] 在一些實(shí)施方式中，所述IL-2可W是環(huán)狀排列的（CP)。在一些實(shí)施方式中，所述 IL-2可W是對IL-2祕比對天然IL-2具有更高選擇性的突變型IL-2,或者是對IL-2R 丫比對 天然IL-2具有更高選擇性的突變型IL-2、或者破壞IL-2祕和IL-2R 丫之間的關(guān)聯(lián)的突變型 比-2。
[0017] 在一些實(shí)施方式中，所述融合蛋白可W進(jìn)一步包含接頭。所述接頭可W具有序列 GS或者是泛素或者泛素變體分子。
[0018] 在一些方面，提供了編碼本文所述的融合蛋白的核酸分子、或者包含所述核酸分 子的載體、或者包含所述載體的宿主細(xì)胞。
[0019] 在一些方面，提供了包含本文所述的融合蛋白、編碼所述融合蛋白的核酸分子、或 者包含所述核酸分子的載體、或者包含所述載體的宿主細(xì)胞的藥物組合物。
[0020] 在一些方面，提供了一種誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法，所述方法通過如下方式來進(jìn)行：向 需要的受試者施用包含促調(diào)亡Bd-2家族多膚的融合蛋白、編碼所述融合蛋白的核酸分子、 包含所述核酸分子的載體、或者包含所述載體的宿主細(xì)胞。
[0021] 在一些方面，提供了一種誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法，所述方法通過如下方式來進(jìn)行:使 表達(dá)IL-2R的祀細(xì)胞與包含促調(diào)亡Bd-2家族多膚的融合蛋白、編碼所述融合蛋白的核酸分 子、或者包含所述核酸分子的載體接觸。
[0022] 在一些方面，提供了一種治療癌癥的方法，所述方法通過如下方式來進(jìn)行：向需要 的受試者施用包含促調(diào)亡Bcl-2家族多膚的融合蛋白、編碼所述融合蛋白的核酸分子、包含 所述核酸分子的載體、或者包含所述載體的宿主細(xì)胞。
[0023] 在一些方面，提供了一種治療癌癥的方法，所述方法通過如下方式來進(jìn)行:使表達(dá) 比-2R的寶生性細(xì)胞與包含促調(diào)亡Bd-2家族多膚的融合蛋白、編碼所述融合蛋白的核酸分 子、或者包含所述核酸分子的載體接觸。
[0024] 在一些方面，提供了一種治療癌癥的方法，所述方法通過如下方式來進(jìn)行:使在腫 瘤微環(huán)境中表達(dá)IL-2R的非惡性細(xì)胞與包含促調(diào)亡Bd-2家族多膚的融合蛋白、編碼所述融 合蛋白的核酸分子、或者包含所述核酸分子的載體接觸。
[0025] 在一些方面，提供了一種治療癌癥的方法，所述方法通過如下方式來進(jìn)行:使表達(dá) 化-2R的免疫細(xì)胞與包含促調(diào)亡Bcl-2家族多膚的融合蛋白、編碼所述融合蛋白的核酸分 子、或者包含所述核酸分子的載體接觸。在一些實(shí)施方式中，所述免疫細(xì)胞是天然殺手細(xì)胞 并且所述融合蛋白是抗調(diào)亡Bd-2家族多膚。在一些另外可選的實(shí)施方式中，所述免疫細(xì)胞 是調(diào)節(jié)T細(xì)胞并且所述融合蛋白是促調(diào)亡Bd-2家族多膚。
[0026] 在一些方面，提供了一種治療自身免疫性素亂的方法，所述方法通過如下方式來 進(jìn)行：向需要的受試者施用包含促調(diào)亡Bcl-2家族多膚的融合蛋白、編碼所述融合蛋白的核 酸分子、包含所述核酸分子的載體、或者包含所述載體的宿主細(xì)胞。
[0027] 在一些方面，提供了一種刺激細(xì)胞增殖的方法，所述方法通過如下方式來進(jìn)行：向 需要的受試者施用包含抗調(diào)亡Bd-2家族多膚的融合蛋白、編碼所述融合蛋白的核酸分子、 包含所述核酸分子的載體、或者包含所述載體的宿主細(xì)胞。
[0028] 在一些方面，提供了一種刺激細(xì)胞增殖的方法，所述方法通過如下方式來進(jìn)行:使 表達(dá)IL-2R的祀細(xì)胞與包含抗調(diào)亡Bd-2家族多膚的融合蛋白、編碼所述融合蛋白的核酸分 子、或者包含所述核酸分子的載體接觸。
[0029] 在一些方面，提供了一種增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法，所述方法通過如下方式來進(jìn)行：向 需要的受試者施用包含抗調(diào)亡Bd-2家族多膚的融合蛋白、編碼所述融合蛋白的核酸分子、 包含所述核酸分子的載體、或者包含所述載體的宿主細(xì)胞。
[0030] 在一些方面，提供了一種增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法，所述方法通過如下方式來進(jìn)行:使 表達(dá)IL-2R的祀細(xì)胞與包含抗調(diào)亡Bd-2家族多膚的融合蛋白、編碼所述融合蛋白的核酸分 子、或者包含所述核酸分子的載體接觸。
[0031] 在一些方面，提供了一種繁殖或者擴(kuò)大培養(yǎng)用于在過繼性細(xì)胞轉(zhuǎn)移療法或者嵌合 抗原受體(CAR)療法中使用的經(jīng)改造的T細(xì)胞的方法，所述方法包括使所述經(jīng)改造的T細(xì)胞 與根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白、編碼所述融合蛋白的核酸分子、或者包含所述核酸分子的載體 接觸。
[0032] 在一些方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白、編碼所述融合蛋白的核酸分子、或者 包含所述核酸分子的載體用于在需要的受試者中或者細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡、治療癌癥、治 療自身免疫性素亂、刺激細(xì)胞增殖、增強(qiáng)免疫應(yīng)答、或者繁殖或擴(kuò)大培養(yǎng)用于在過繼性細(xì)胞 轉(zhuǎn)移療法或者嵌合抗原受體(CAR)療法中使用的經(jīng)改造的T細(xì)胞的應(yīng)用。
[0033] 在另外可選的方面的各個(gè)實(shí)施方式中，所述受試者可W是人類。
[0034] 本
【發(fā)明內(nèi)容】
部分不一定描述本發(fā)明的所有特征。
【附圖說明】
[0035] 根據(jù)下文的其中參考附圖的說明可W使本發(fā)明的運(yùn)些和其他特征更加清楚，其 中：
[0036] 圖1是PGW07大腸桿菌表達(dá)載體的展示圖。
[0037] 圖2A-B顯示proS2-BAD的核酸序列(A)和氨基酸序列(B)。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 本發(fā)明部分地提供了包括結(jié)合至Bcl-2家族蛋白的IL-2蛋白的融合蛋白及其應(yīng) 用。
[0039] IL-2 蛋白
[0040] IL-2蛋白包括天然IL-2W及變體型IL-2蛋白。本文使用的"天然的"或"野生型" IL-2序列是指人類IL-2序列（例如，登錄號為No. NP_000577.2)，不管是從天然來源純化還 是使用重組技術(shù)制得。在一些實(shí)施方式中，野生型比-2序列包括Proleukin'取(阿地白介素） 序列：
[0041] PTSSSTKKT化QLEHL化DLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQ化E邸LKPLEE化NLAQSKNF HLRPWLISNINVIVLELKGWTTFMCEYADETATIVEFLNroHTFAQSIISTLT(SEQIDNO:l).
[0042] 在一些實(shí)施方式中，可W在本公開內(nèi)容的所述融合蛋白中使用的IL-2蛋白是運(yùn)樣 的變體型11-2蛋白，該變體型11-2蛋白對IL-2地比對天然IL-2具有的選擇性高，或者對IL-2R 丫比對天然IL-2具有的選擇性高，或者破壞IL-2郎和IL-2R 丫之間的關(guān)聯(lián)，如在例如WO 2012/088446 中所述。
[0043] 在一些實(shí)施方式中，可W在本公開內(nèi)容的所述融合蛋白中使用的IL-2蛋白包括如 下氨基酸序列：
[0044] PTSSSTKKT化QLEHL化DLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQ化E邸LKPLEE化NLAgSKNF H^^PRDXXSNINVgVLELKG沈TTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISl'LT(沈Q ID N0:2).
[0045] 在一些實(shí)施方式中，可W在本公開內(nèi)容的所述融合蛋白中使用的IL-2蛋白包括如 下氨基酸序列：
[0046] PTSSSTKKT化QLEHL化DLQMILNGINNYKNPKLTRMLT^KFYMPKKATELKHLQ化E邸LKPLEE化NLAgSKNF H哩P畑XXSNINVEVLELKG沈TTFMCEYADETATIVE化NWHT巧QSIISTLT(ProS2)(沈Q ID N0:2).
[0047] 在一些實(shí)施方式中，破壞IL-2祕和IL-2R 丫之間的關(guān)聯(lián)的IL-2蛋白與野生型IL-2 相比包括如下取代：18R、2沈、8(^、810、85￥、861、891、93￥和1261';或者181?、226、745、801^、 811\85￥、861、891、92尸、93￥和1261';或者181?、226、80尸、810、85￥、86￥、891、92尸、93￥和1261'。
[0048] 在一些實(shí)施方式中，能夠在本公開內(nèi)容的融合蛋白中使用的IL-2蛋白是環(huán)狀排列 的（circularly permuted,CP)，如在例如于2000年1月4日授予化Stan等的美國專利No.6, Oll ,002中所述。
[0049] 在一些另外可選的實(shí)施方式中，可W在本公開內(nèi)容的所述融合蛋白中使用的 cpIL-2蛋白包括如下蛋白：
[(K)加 ] MLT全KFYMPKKATELKHLQ化E邸LKPLEEVLNLAgSKNFH哩P畑XXSNINVgVLELKG沈TTFMCEYADETATIV 邸LNRW口巧QSIISTLTGGNGGPTSSSTKKT化化邸化LDLQMILNGINNYKNPKLT(cpProS2)(SEQ ID N0：4).
[0051] 能夠在本公開內(nèi)容的融合蛋白中使用的例示性IL-2蛋白包括本文所述的那些IL-2蛋白，W及與天然的IL-2具有至少80%的序列同一性、至少85%、至少90%、至少95%、至 少98%、或者甚至是至少99%的序列同一性的序列（"變體型IL-2蛋白"），只要所述變體型 IL-2蛋白保持結(jié)合IL-2受體的能力，或者對IL-2祕比對天然IL-2具有的選擇性高，或者對 比-2R 丫比對天然比-2具有的選擇性高，或者破壞如在WO 2012/088446或者Levin等Na化re 484:529-533,2012中所述的IL-2祕和IL-2R 丫之間的關(guān)聯(lián)，或者保持所需要的生物活性。
[0052] 應(yīng)當(dāng)理解的是，根據(jù)本公開內(nèi)容的IL-2蛋白包括可W比天然氨基酸IL-2蛋白短的 片段，只要IL-2蛋白片段保持結(jié)合IL-2受體的能力，或者保持對IL-2祕比對天然IL-2具有 高的選擇性，或者保持對IL-2R 丫比對天然IL-2具有高的選擇性，如在WO 2012/088446或者 Levin等化化re 484: 529-533,2012中所述，或者保持所需要的生物活性，不管是作為天然 序列的片段還是為其CP形式或者片段。
[0053] 還應(yīng)當(dāng)理解的是，本公開內(nèi)容涵蓋編碼本文所述的或者本領(lǐng)域已知的IL-2蛋白的 核酸分子。
[0化4]例示性的IL-2核酸分子包括：
[0化5]

[0化7] B化-2家族蛋白
[0058] Bcl-2相關(guān)蛋白或者多膚（r'Bcl-2家族蛋白"或者"Bcl-2家族成員"）參與調(diào)亡的 調(diào)節(jié)。Bcl-2家族蛋白分為兩個(gè)明顯不同的類別：抑制細(xì)胞死亡的那些Bcl-2家族蛋白（"抗 調(diào)亡"Bcl-2家族蛋白）和促進(jìn)細(xì)胞死亡的那些Bcl-2家族蛋白（"促調(diào)亡"Bcl-2家族蛋白）。 Bcl-2家族蛋白共同具有1至4個(gè)保守的Bc ^2同源(BH)域，它們稱為Mll、B肥、B冊和BH4。 [0化9]抗調(diào)亡 Bd-2家族蛋白包括 Bcl-2 本身、Bcl-XL(Boi