一種生物表面活性劑強(qiáng)化植物—微生物共生體系的方法及其在原位修復(fù)鈾污染土壤中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于鈾污染土壤修復(fù)領(lǐng)域，特別涉及一種生物表面活性劑強(qiáng)化植物一微生物共生體系的方法及其在原位修復(fù)鈾污染土壤中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]土壤是生態(tài)環(huán)境的重要組成部分，是一個(gè)人類賴以生存的介于生物界和非生物界之間的復(fù)雜、開放的物質(zhì)系統(tǒng)，也是一個(gè)能夠支持植物、動(dòng)物和微生物生長與繁殖的生物地球化學(xué)循環(huán)的儲(chǔ)存庫。隨著我國核工業(yè)和核能的快速發(fā)展，鈾的使用量每年仍在不斷增加，由此產(chǎn)生的鈾礦廢石也很多。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，一個(gè)年產(chǎn)量為10萬噸的鈾礦山，產(chǎn)生的鈾礦廢石的量將達(dá)到40?50萬噸，其中鈾的含量約為I X 10—4?3 X 10—4 g/g，是正常土壤的天然本底值的4?10倍。同時(shí)，鈾礦廢石中的鈾、釷、鐳等放射性核素在各種水文地球化學(xué)的作用下，會(huì)轉(zhuǎn)化為可以迀移的各種形態(tài)和價(jià)態(tài)，通過地表徑流、地下滲流和淋洗，污染周邊的土壤，并通過生物富集作用在人體內(nèi)的積累，危害人們健康，給人類生存環(huán)境造成一定的威脅。因此，鈾污染土壤的修復(fù)，是保障土壤質(zhì)量的首要任務(wù)，也對(duì)實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)社會(huì)可持續(xù)發(fā)展和保護(hù)人類健康的必要舉措。
[0003]鈾污染土壤修復(fù)主要有客土法、填埋法、覆蓋新土法、電動(dòng)修復(fù)法、堆浸去污法、鈍化法和化學(xué)淋洗法等，但是這些傳統(tǒng)的物理、化學(xué)方法處理成本較高，容易對(duì)環(huán)境造成破壞性二次污染，而且工藝流程冗長，后續(xù)處理繁瑣，所生成的廢物還需二次處理。植物修復(fù)法是一種利用超積累植物將鈾污染土壤中的鈾以離子或者化合物的形式，轉(zhuǎn)移到植物體內(nèi)的原位修復(fù)方法，具有操作簡單、費(fèi)用低廉、不造成二次污染且資源化利用等優(yōu)點(diǎn)，逐漸引起了人們的廣泛關(guān)注，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0004]然而，植物修復(fù)也有一定的局限性，如修復(fù)植物對(duì)鈾的耐性有限，植物生長周期較長，外界環(huán)境因素對(duì)修復(fù)植物影響較大，一些固定態(tài)和沉淀態(tài)的鈾修復(fù)植物不易吸收等。很多學(xué)者通過外加化學(xué)物質(zhì)強(qiáng)化植物修復(fù)，效果雖然明顯，但存在修復(fù)成本增加，環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)大，外加的化學(xué)物質(zhì)容易造成二次污染。
[0005]利用植物與微生物之間互利關(guān)系，探索一條既能大幅度提高植物修復(fù)鈾污染土壤的效率、又能改善土壤生態(tài)環(huán)境，資源節(jié)約、環(huán)境友好且成本低廉的生物表面活性劑強(qiáng)化植物一微生物共生體系新方法，并能夠真正實(shí)現(xiàn)綠色、高效、環(huán)保原位修復(fù)鈾污染土壤，將具有重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明目的在于提供一種生物表面活性劑強(qiáng)化植物一微生物共生體系的方法。具體以無鈾污染土壤、蛭石、泥炭土為培養(yǎng)基質(zhì)，以蓖麻為土壤宿主植物，以叢枝菌根為接種微生物，首先利用育苗裝置培養(yǎng)蓖麻幼苗，在填充有培養(yǎng)基質(zhì)的泡沫漂浮孔穴育苗盆中對(duì)蓖麻種子進(jìn)行叢枝菌根真菌接種，形成蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系，再使用自制的生物表面活性劑菌株液體代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法使用的化學(xué)表面活性劑，對(duì)蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系進(jìn)行強(qiáng)化，得到一種生物表面活性劑強(qiáng)化功能的蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系，并將其應(yīng)用于原位修復(fù)鈾污染土壤中。具體步驟如下:
(1)培養(yǎng)基質(zhì)的制備
將無鈾污染土壤、蛭石和泥炭土按照一定質(zhì)量比進(jìn)行混合，并進(jìn)行滅菌處理，即可得到所需的培養(yǎng)基質(zhì)；
(2)生物表面活性劑菌株液體的制備
取10 g處理后的堆肥樣品，置于裝有90 mL無菌水的250 mL三角瓶中振蕩25 min后，靜止30 min，得到土壤懸液。吸取2 mL土壤懸浮液接種到富集培養(yǎng)基中，放入溫度為25 °C、轉(zhuǎn)速為220 r/min的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)5 d。吸取上述I mL富集培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，放入溫度為30 °C、轉(zhuǎn)速為220 r/min的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，直至觀測到乳化現(xiàn)象。取I mL稀釋至10—3之后，以該稀釋發(fā)酵液I mL涂布于平板培養(yǎng)基上，于37 °C恒溫靜置培養(yǎng)3 d。挑選平板長勢良好的菌落進(jìn)行劃線分離，按照上述方法進(jìn)行再次發(fā)酵培養(yǎng)、馴化2次，即可得到馴化后的菌株。將馴化后的菌株在富集培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)I d后，吸取I mL菌液按4.5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH值為6.5，在溫度為25 °C、轉(zhuǎn)速為200 r/min的恒溫培養(yǎng)箱中，繼續(xù)進(jìn)行振蕩培養(yǎng)2 d后，即為生物表面活性劑菌株液體。
[0007](3)蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系的建立
將培養(yǎng)基質(zhì)裝入20 cm X 15 cm規(guī)格的泡沫漂浮孔穴育苗盆中，每盆I kg，按照基質(zhì)質(zhì)量的15 %澆水，待水分滲透均勻后，在基質(zhì)表層均勻噴灑一定質(zhì)量的叢枝菌根菌劑。使用10 % H2O2對(duì)蓖麻種子浸泡25 min，將其陰干后均勻撒種在培養(yǎng)基中，每盆4顆。然后，使用保鮮膜對(duì)泡沫漂浮孔穴育苗盆進(jìn)行覆蓋，以此保濕、增溫，促進(jìn)蓖麻孢子萌芽、發(fā)育，為保障供應(yīng)蓖麻孢子萌芽、發(fā)育及其后期幼苗生長所需的空氣，同時(shí)方便后期管理，在撒播蓖麻種子上方處的保鮮膜上扎孔4個(gè)。待蓖麻萌芽至單株含有80?100個(gè)菌根真菌孢子后，使泡沫漂浮孔穴育苗盆的下半部分浸入水中，待蓖麻種子出苗后間苗，每孔留苗I顆，并把水換成1/10強(qiáng)度的改良霍格蘭德營養(yǎng)液，3天后換成1/4強(qiáng)度的改良霍格蘭德營養(yǎng)液，2周后再更換一次1/4強(qiáng)度的改良霍格蘭德營養(yǎng)液。同時(shí)，每天對(duì)蓖麻萌芽使用含有生物表面活性劑菌株液體的水進(jìn)行均勻噴淋，保持培養(yǎng)基質(zhì)的含水量60%，在室溫下繼續(xù)培育10 d后，即可得到生物表面活性劑強(qiáng)化功能的蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系。
[0008](4)鈾污染土壤的原位修復(fù)
將無鈾污染土壤自然風(fēng)干，過篩后，取I kg裝入50 cm X 25 cm規(guī)格的塑料花盆中，拌入河砂150 g，有機(jī)肥50 g后，然后將UO2(NO3)2.6 H2O溶液均勻噴灑在土壤中，充分?jǐn)嚢杌旌虾蟮玫解櫸廴驹囼?yàn)土壤。然后將上述栽培的蓖麻幼苗整株及其周圍的培養(yǎng)基質(zhì)一起取出，移栽在鈾污染試驗(yàn)土壤中。鈾污染土壤原位修復(fù)試驗(yàn)在人工氣候室內(nèi)完成，將塑料花盆放在長木架上，控制室內(nèi)溫度，每天光照8 h，并定時(shí)澆水以保持土壤持水量在60 %。蓖麻移栽60 d后，沿土面剪取植株地上部分，同時(shí)洗出根系，在110 °(:下殺青，70 °C烘干(24 h)，分根、莖、葉稱干重，各部分植物樣品經(jīng)磨碎后，用硝酸-高氯酸消解，使用ICP-AES測定各部分植物中總鈾的量。
[0009]本發(fā)明所述的步驟(I)中培養(yǎng)基質(zhì)的制備，使用的無鈾污染土壤質(zhì)量是I?2kg；蟲至石質(zhì)量是1.5 ~ 4.5 kg和泥炭土的質(zhì)量是0.5?0.8 kg。
[0010]本發(fā)明所述的的步驟(2)中生物表面活性劑菌株液體的制備，使用的富集培養(yǎng)基組成是:氯化鉀1.5 g;硫酸銨12 g;氯化鈉1.2 g;七水硫酸亞鐵3 X 10—5 g;磷酸氫二鉀
3.5g;三水磷酸氫二鉀0.65 g；EDTA 1.1 g;酵母浸膏0.6 g;植物油5 g;蒸餾水1000 mL。
[0011]本發(fā)明所述的的步驟(2)中生物表面活性劑菌株液體的制備，使用的發(fā)酵培養(yǎng)基組成是:氯化鉀1.5 g;硫酸銨12 g;氯化鈉1.2 g;七水硫酸亞鐵3 X 10—5 g;磷酸氫二鉀
3.5g;三水磷酸氫二鉀0.65 g;硫酸鎂0.6 g;氯化鈣0.25 g;硫酸鋅0.3 g;硫酸銅0.3 g；EDTA 1.1 g;酵母浸膏0.6 g;植物油5 g;蒸餾水1000 mL。
[0012]本發(fā)明所述的的步驟(2)中生物表面活性劑菌株液體的制備，使用的平板培養(yǎng)基組成是:葡萄糖20 g;蛋白胨5 g;酵母浸膏0.25 g;瓊脂20 g;蒸饋水1000 mL。
[0013]本發(fā)明所述的步驟(3)中蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系的建立，使用的叢枝菌根菌劑為地表球囊霉、無梗囊霉和盾巨孢囊霉中的任意一種。
[0014]本發(fā)明所述的步驟(3)中蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系的建立，使用的叢枝菌根菌劑的質(zhì)量是50?60 go
[0015]本發(fā)明所述的步驟(3)中蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系的建立，使用的改良霍格蘭德營養(yǎng)液組成是:四水硝酸鈣945 mg/L;硝酸鉀506 mg/L;硝酸銨80 mg/L;磷酸二氫鉀136 mg/L;硫酸鎂493 mg/L;鐵鹽溶液2.5 mL;微量元素液5 mL;蒸饋水500 mL;pH=6.0。本發(fā)明所述的步驟(3)中蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系的建立，使用的鐵鹽溶液組成是:七水硫酸亞鐵2.78 g;乙二胺四乙酸二鈉3.73g;蒸餾水500 mL;pH=5.5。
[0016]本發(fā)明所述的步驟(3)中蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系的建立，使用的微量元素液組成是:碘化鉀0.83 mg/L;硼酸6.2 mg/L;硫酸錳22.3 mg/L;硫酸鋅8.6 mg/L;鉬酸鈉
0.25 mg/L;硫酸銅0.025 mg/L;氯化鈷0.02 5mg/L;蒸餾水500 mL。
[0017]本發(fā)明所述的步驟(3)中蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系的建立，使用的含有生物表面活性劑菌株液體的體積百分比是0.2?0.4 %。
[0018]本發(fā)明所述的步驟(4)中鈾污染土壤的原位修復(fù)，鈾污染土壤中含鈾的量為25?75 mg U / kg 土。
[0019]本發(fā)明所述的步驟(4)中鈾污染土壤的原位修復(fù)，控制室內(nèi)溫度，具體措施是:白天溫度20?30 °C，夜間溫度16 - 20 °C。
[0020]本發(fā)明所述的一種生物表面活性劑強(qiáng)化植物一微生物共生體系的方法及其在原位修復(fù)鈾污染土壤中的應(yīng)用，相比現(xiàn)有的技術(shù)，具有以下顯著優(yōu)點(diǎn):
(I)本發(fā)明采用生物表面活性劑強(qiáng)化功能的蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系來原位修復(fù)鈾污染土壤，系綠色原位修復(fù)，不會(huì)造成二次污染，同時(shí)修復(fù)過程不會(huì)破壞原有的生態(tài)環(huán)境，并有助于改善因鈾污染而引起的土壤退化和生產(chǎn)力下降等趨勢，恢復(fù)并提高鈾污染土壤的生物多樣性等多重優(yōu)點(diǎn)。具有易于管理、成本低、修復(fù)效率高、環(huán)境友好、具有潛在經(jīng)濟(jì)效益等多重優(yōu)勢。
[0021](2)本發(fā)明在對(duì)植物-微生物共生體系進(jìn)行強(qiáng)化過程中，將自制的一種生物表面活性劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化學(xué)表面活性劑，從而減少了對(duì)環(huán)境的二次污染。
[0022](3)本發(fā)明所使用的主要物質(zhì)來源是廉價(jià)的自然資源物質(zhì)，來源廣泛，不限產(chǎn)地，不需要特許功能性加工。
[0023](4)本發(fā)明所選擇的宿主植物生長周期短，生物量較大，且不易進(jìn)入食物鏈傳遞而增加環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，從而避免了繁瑣的后續(xù)處理過程。
[0024](5)本發(fā)明在試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用漂浮育苗法，并使用生物表面活性劑強(qiáng)化措施建立了一種生物表面活性劑強(qiáng)化功能的蓖麻幼苗一菌根真菌共生體系，并對(duì)污染濃度為25?75 mg U / kg 土的鈾污染土壤具有較強(qiáng)的修復(fù)能力。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面通過對(duì)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，它們只是用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述發(fā)明的內(nèi)容做出一些非本質(zhì)的改進(jìn)或調(diào)整，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。
[0026]實(shí)施例1:
(1)培養(yǎng)基質(zhì)的制備
將I kg自然風(fēng)干，過篩后的無鈾污染土壤，與3 kg輕石和0.8 kg泥炭土進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，均勻混合，并?20 °C高壓蒸汽中進(jìn)行滅菌處理2 h，