本發(fā)明屬于萃取介質(zhì)領(lǐng)域，具體涉及一種食品樣品痕量磺胺類藥物殘留的萃取分離所用的固相微萃取纖維的制備方法。

背景技術(shù)：

磺胺類藥物具有價(jià)格低廉，使用方便，藥效顯著的優(yōu)點(diǎn)，因而在預(yù)防和治療感染性疾病的臨床治療與畜牧養(yǎng)殖等方面有著廣泛的應(yīng)用?；前奉惈F藥的不規(guī)范應(yīng)用容易造成其在動(dòng)物組織中的殘留，其潛在致癌性和抗藥性也逐漸顯現(xiàn)出來(lái)，最終將會(huì)影響到人類的身體健康，同時(shí)，磺胺類獸藥的殘留也限制了我國(guó)動(dòng)物性食品的出口，影響我國(guó)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。為了保證食品質(zhì)量安全與人類身體健康，世界各國(guó)家和地區(qū)都有相關(guān)的規(guī)定出臺(tái)，對(duì)磺胺類獸藥的殘留量做了嚴(yán)格的限制。

動(dòng)物性食品樣品基質(zhì)組成復(fù)雜，在磺胺類藥物的檢測(cè)中會(huì)造成干擾，也影響了精密儀器的檢測(cè)限和精密度，因此需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理。固相微萃取具有無(wú)溶劑或少溶劑使用，操作簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化以及在線聯(lián)用其他儀器等優(yōu)點(diǎn)。

商品化的固相微萃取材料具有廣譜性，不具備特異選擇性，在凈化目標(biāo)分析物時(shí)會(huì)吸附基質(zhì)中的其他成分，會(huì)對(duì)分析物的檢測(cè)造成干擾。對(duì)磺胺類藥物具有特異選擇性的固相微萃取材料的制備，使其同時(shí)具有高效萃取和特異性識(shí)別能力，在樣品前處理技術(shù)中顯現(xiàn)出其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。但是關(guān)于磺胺類藥物具有特異性的固相微萃取纖維，卻鮮有披露。

因此，研究一種可以快速、方便富集多種磺胺類獸藥的固相微萃取材料具有較深遠(yuǎn)的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種高效、方便的特異選擇吸附磺胺類藥物固相微萃取材料的制備方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了固相微萃取材料在動(dòng)物源性食品中對(duì)磺胺二甲基嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺噻唑等其他磺胺類獸藥檢測(cè)的應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)證明，該材料可以直接用于動(dòng)物源性食品中磺胺二甲基嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺噻唑、磺胺多辛、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺甲基惡唑、磺胺甲氧嗪磺胺異噁唑和磺胺氯噠嗪十種磺胺類獸藥，其對(duì)磺胺類藥物具有高選擇性吸附和高效富集。

對(duì)磺胺類藥物具有特異性的固相微萃取纖維的制備方法，包括下述的步驟：

(1)制備預(yù)聚合溶液：

將磺胺二甲基嘧啶充分溶解在乙腈中，加入功能單體，再加入交聯(lián)劑；充分混合后加入偶氮二異丁腈，得預(yù)聚合溶液；

(2)對(duì)步驟(1)中制備所得的預(yù)聚合溶液除氧操作；

(3)制備固相微萃取材料：

a.取玻璃毛細(xì)管，用酸溶液浸泡，蒸餾水洗凈，再用氫氧化鈉溶液浸泡，蒸餾水洗凈，n2吹干；

b.在a中處理好的毛細(xì)管中注滿經(jīng)過步驟(2)處理的預(yù)聚合溶液，密封端口，老化；

c.取出b中的毛細(xì)管，真空烘干，室冷卻，折斷毛細(xì)管，即得固相微萃取材料；

d.將c制備的固相微萃取材料洗脫至無(wú)磺胺二甲基嘧啶檢出，保存?zhèn)溆谩?/p>

功能單體為甲基丙烯酸，交聯(lián)劑為：乙二醇二甲基丙烯酸酯和3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基丙烯酸酯。

優(yōu)選的，對(duì)磺胺類藥物具有特異性的固相微萃取纖維的制備方法，包括下述的步驟：

(1)將磺胺二甲基嘧啶溶解在乙腈中，超聲使其充分溶解，加入功能單體甲基丙烯酸超聲處理，再加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯和3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基丙烯酸酯，超聲使所有試劑充分混合，再加入偶氮二異丁腈，超聲溶解，得到預(yù)聚合溶液；

以上磺胺二甲基嘧啶、乙腈、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈之間的摩爾比為：4:200:60:120:100:3；

(2)將步驟(1)制備的預(yù)聚合溶液超聲，通氮?dú)?，除去氧氣，避光密封保存?/p>

(3)固相微萃取材料制備，其步驟如下：

a.取玻璃毛細(xì)管，用鹽酸溶液浸泡，蒸餾水洗凈，再用氫氧化鈉溶液浸泡，蒸餾水洗凈，n2吹干；

b.在a中處理好的毛細(xì)管中注滿經(jīng)過步驟(2)處理的預(yù)聚合溶液，密封端口，老化；

c.取出經(jīng)b處理后的毛細(xì)管，真空烘干，冷卻，折斷毛細(xì)管，得固相微萃取材料；

d.將c制備的固相微萃取材料洗脫直至無(wú)磺胺二甲基嘧啶檢出，超純水洗滌后保存?zhèn)溆谩?/p>

更具體的，對(duì)磺胺類藥物具有特異性的固相微萃取纖維的制備方法，包括下述的步驟：

(1)將556mg的磺胺二甲基嘧啶溶解在5.5ml的乙腈中，超聲使其充分溶解，然后再加入256μl功能單體甲基丙烯酸超聲5min，再加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯1.128ml和1.188ml3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基丙烯酸酯，超聲5min使所有試劑充分混合，再加入偶氮二異丁腈25mg，超聲溶解，得到預(yù)聚合溶液；

(2)將步驟1)制備的預(yù)聚合溶液超聲2min，通氮?dú)?min，重復(fù)操作5～10次以除去氧氣，置于4℃冰箱避光密封保存；

固相微萃取材料制備，其步驟如下：

a取內(nèi)徑為0.5mm的10cm玻璃毛細(xì)管，依次用1mol/l鹽酸溶液浸泡30min，蒸餾水洗凈，再用1mol/l氫氧化鈉溶液浸泡30min，蒸餾水洗凈，n2吹干；

b在a中處理好的毛細(xì)管中注滿經(jīng)過步驟(2)處理的預(yù)聚合溶液，硅橡膠塊密封端口，置于水浴鍋中60℃老化10h；

c取出步驟b制備的毛細(xì)管，于真空干燥箱60℃烘干3h，室溫冷卻后，折斷毛細(xì)管，輕敲毛細(xì)管的一端，即得白色柱狀固相微萃取材料；

d將步驟c制備的固相微萃取材料置于盛有洗脫液的試管中，超聲洗脫，直至無(wú)磺胺二甲基嘧啶檢出，然后用超純水超聲洗滌3次，60℃真空干燥后保存?zhèn)溆谩?/p>

對(duì)d所得的固相微萃取材料進(jìn)行吸附性能表征，確定特異選擇性結(jié)合位點(diǎn)的存在；

表征方法包括動(dòng)態(tài)吸附、靜態(tài)吸附和選擇性實(shí)驗(yàn)。

洗脫液為甲醇和乙酸組成的混合溶液，甲醇：乙酸＝9:1(體積比)。

對(duì)磺胺類藥物具有特異性的固相微萃取纖維在分離磺胺噻唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺多辛、磺胺氯噠嗪、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺甲氧嗪、磺胺惡唑和磺胺異噁唑中的應(yīng)用，也是本發(fā)明所要保護(hù)的范圍，將本發(fā)明制備得到的固相微萃取纖維應(yīng)用到上述的藥物中，具有高選擇性吸附和高效富集的特點(diǎn)。

通過上述的方法制備所得的固相微萃取纖維應(yīng)用于食品樣品痕量磺胺類藥物殘留的萃取分離應(yīng)用中，采用原位聚合法在二氧化硅毛細(xì)管中制備對(duì)磺胺類藥物具有特異性固相微萃取纖維，然后對(duì)材料進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征和性能評(píng)價(jià)，并將制備的材料作為固相微萃取的萃取介質(zhì)，萃取分離磺胺類藥物采用高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)。

上述的應(yīng)用，具體包括下述的步驟：(1)將處理好的固相微萃取材料截成3cm長(zhǎng)的小段，在纖維小段的一端固定在一次性注射器上，得固相微萃取裝置；

(2)量取5ml待測(cè)溶液于5ml螺口小瓶中，小瓶中加磁力攪拌子，調(diào)節(jié)步驟(1)中的固相微萃取裝置，使2.5cm的纖維束沒入萃取液中，在低轉(zhuǎn)速下萃取3min；

(3)萃取結(jié)束后將步驟(2)中萃取纖維束取下，置于1.5ml離心管中，加入1ml洗脫液超聲洗脫10min，洗脫液過膜后入高效液相色譜檢測(cè)。

本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明的方法所制備的固相微萃取材料具有操作使用方便、特異性吸附能力強(qiáng)、回收率高和制備成本低的特點(diǎn)，同時(shí)也克服了傳統(tǒng)樣品前處理技術(shù)的所需溶劑量大的缺點(diǎn)。本發(fā)明的材料制備工藝步驟簡(jiǎn)單，可以多次循環(huán)利用，解決了商品化固相微萃取纖維選擇性吸附差的問題。

附圖說(shuō)明

圖1為10mg特異選擇性固相微萃取材料在5ml30mg/lsmz乙腈-水溶液中的動(dòng)態(tài)吸附曲線；

圖2為磺胺類獸藥特異選擇性固相微萃取材料的準(zhǔn)一級(jí)吸附動(dòng)力學(xué)方程擬合圖；

圖3為磺胺類獸藥特異選擇性固相微萃取材料的準(zhǔn)二級(jí)吸附動(dòng)力學(xué)方程擬合圖；

圖4為磺胺類獸藥特異選擇性固相微萃取材料的顆粒內(nèi)擴(kuò)散方程擬合圖；

圖5為磺胺類獸藥特異選擇性固相微萃取材料的elovich方程擬合圖；

圖6為特異選擇性固相微萃取材料和非特異選擇性固相微萃取材料對(duì)smz-乙腈溶液的吸附等溫線；

圖7為特異選擇性固相微萃取材料scatchard分析；

圖8為雞蛋樣品加標(biāo)50μg/kg的十種磺胺類藥物色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式來(lái)對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的說(shuō)明，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解本發(fā)明，但并不以此限制本發(fā)明。

實(shí)施例1

固相微萃取纖維材料的制備方法如下：

對(duì)磺胺類藥物具有特異性的固相微萃取纖維的制備方法，包括下述的步驟：

(1)將556mg的磺胺二甲基嘧啶溶解在5.5ml的乙腈中，超聲使其充分溶解，然后再加入256μl功能單體甲基丙烯酸超聲5min，再加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯1.128ml和1.188ml3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基丙烯酸酯，超聲5min使所有試劑充分混合，再加入偶氮二異丁腈25mg，超聲溶解，得到預(yù)聚合溶液；

(2)將步驟1)制備的預(yù)聚合溶液超聲2min，通氮?dú)?min，重復(fù)操作5～10次以除去氧氣，置于4℃冰箱避光密封保存；

固相微萃取材料制備，其步驟如下：

a取內(nèi)徑為0.5mm的10cm玻璃毛細(xì)管，依次用1mol/l鹽酸溶液浸泡30min，蒸餾水洗凈30min(洗瓶器洗滌，以下實(shí)施例同)，再用1mol/l氫氧化鈉溶液浸泡30min，蒸餾水洗凈30min(洗瓶器洗滌)，n2吹干；

b在a中處理好的毛細(xì)管中注滿經(jīng)過步驟(2)處理的預(yù)聚合溶液，硅橡膠塊密封端口，置于水浴鍋中60℃老化10h；

c取出步驟b制備的毛細(xì)管，于真空干燥箱60℃烘干3h，室溫冷卻后，折斷毛細(xì)管，輕敲毛細(xì)管的一端，即得白色柱狀固相微萃取材料；

d將步驟c制備的固相微萃取材料置于盛有洗脫液的試管中，超聲洗脫，直至無(wú)磺胺二甲基嘧啶檢出，然后用超純水超聲洗滌3次，60℃真空干燥后保存?zhèn)溆?。洗脫液為甲醇和乙酸組成的混合溶液，甲醇：乙酸＝9:1。

制備非選擇性預(yù)聚合溶液的具體步驟如下：

在乙腈加入256μl功能單體甲基丙烯酸超聲5min，再加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯1.128ml和1.188ml3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基丙烯酸酯，超聲5min使所有試劑充分混合，再加入偶氮二異丁腈25mg，超聲溶解，得到非選擇性預(yù)聚合溶液。

實(shí)施例2

固相微萃取材料的吸附性能表征

(1)動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

為了評(píng)價(jià)實(shí)施例1中的固相微萃取材料對(duì)smz的吸附效率，發(fā)明人進(jìn)行了動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)。

稱取10mg固相微萃取材料置于盛有5ml30mg/l的smz乙腈-水溶液的25ml容量瓶中，分別在室溫下振蕩0.25h，0.5h，1h，3h，6h，12h后，吸附結(jié)束后，材料置于1.5ml離心管中，加入1ml洗脫液洗脫10min，取洗脫液過膜后進(jìn)高效液相色譜檢測(cè)洗脫液濃度，測(cè)定了不同時(shí)間內(nèi)固相微萃取材料對(duì)磺胺二甲基嘧啶的吸附容量，結(jié)果見圖1。由圖可知，在0.25～1h內(nèi)，萃取量隨著萃取時(shí)間的增加上升很快，而在3h以后萃取量的上升速度明顯變緩。

目標(biāo)物質(zhì)從液相體系中被固相微萃取材料吸附，是一個(gè)復(fù)雜的過程。對(duì)動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行準(zhǔn)一、二級(jí)吸附動(dòng)力學(xué)、粒子擴(kuò)散方程和elovich方程擬合，可以從動(dòng)力學(xué)角度對(duì)固相微萃取材料吸附機(jī)制的影響因素進(jìn)行分析。

準(zhǔn)一級(jí)吸附動(dòng)力學(xué)方程：

ln(qe-qt)＝lnqe-k1t

式中k1為模型常數(shù)(min^-1)，qt為吸附過程中吸附量(mg/g)，qe為平衡時(shí)吸附量(mg/g)。

準(zhǔn)二級(jí)吸附動(dòng)力學(xué)方程：

式中k2為速率常數(shù)(gmin^-1min^-1)。

粒子擴(kuò)散方程：

qt＝kintt^1/2+c

公式中c為方程常數(shù)，kint為顆粒內(nèi)擴(kuò)散速率常數(shù)(mgg^-1min^-1/2)。

elovich方程：

式中β為化學(xué)吸附程度(gmg^-1)，α為初始吸附速率常數(shù)(mgg^-1g^-1)。

為了研究固相微萃取材料的吸附特性，本實(shí)驗(yàn)中采用準(zhǔn)一級(jí)吸附動(dòng)力學(xué)、準(zhǔn)二級(jí)吸附動(dòng)力學(xué)等對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了擬合，擬合結(jié)果見圖2～5，并得到了一系列動(dòng)力學(xué)參數(shù)，見表1?？梢钥闯鲭m然外界傳質(zhì)和化學(xué)吸附都會(huì)對(duì)萃取過程產(chǎn)生影響，但外界傳質(zhì)的影響稍大一點(diǎn)，吸附速率受顆粒內(nèi)擴(kuò)散限制也很大，以至于整個(gè)吸附過程速率較慢。

表1四種吸附動(dòng)力學(xué)模型擬合結(jié)果

(2)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

為了考察所制備的固相微萃取材料對(duì)smz的吸附能力，稱取10mg固相微萃取材料于25ml容量瓶中，分別加入5ml10～100mg/l之間不同濃度的smz乙腈-水溶液，振蕩吸附3h，將材料取出后在1ml洗脫液中洗脫，通過高效液相色譜檢測(cè)洗脫液的濃度，結(jié)果見圖6。

對(duì)固相微萃取材料的靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用scatchard模型進(jìn)行分析，確定固相微萃取材料平衡結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)的種類，結(jié)果見圖7。

scatchard方程：

式中q為吸附平衡時(shí)吸附容量，ci為萃取液初始濃度，qmax為飽和吸附容量，kd為平衡解離常數(shù)。

由圖6可見隨著初始吸附濃度的增加，特異選擇性固相微萃取材料和非特異選擇性固相微萃取材料的吸附容量都有增加，但是明顯看出非特異選擇性固相微萃取材料的增加幅度要小于特異選擇性固相微萃取材料，同時(shí)，特異選擇性固相微萃取材料scatchard方程r²可達(dá)到0.95，理論上最大吸附量可達(dá)到1.15mg/g。說(shuō)明該方法合成的特異選擇性固相微萃取材料具有特異結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)目標(biāo)物質(zhì)具有特異吸附力。

(3)選擇性實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證特異選擇性固相微萃取材料對(duì)10種磺胺類藥物的選擇吸附性，選擇呋喃妥因和四環(huán)素作為目標(biāo)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)吸附物。特異選擇性固相微萃取材料準(zhǔn)確稱取10mg于25ml容量瓶中，加入1mg/l的磺胺嘧啶(sdz)、磺胺噻唑(stz)、磺胺甲基嘧啶(smr)、磺胺二甲基嘧啶(smz)、磺胺對(duì)甲氧嘧啶(smt)、磺胺甲氧嗪(smp)、磺胺氯噠嗪(scp)、磺胺多辛(sdx)、磺胺甲噁唑(smx)、磺胺異噁唑(sia)、呋喃妥因與四環(huán)素的混合乙腈-水溶液5ml，振蕩吸附3h，將材料取出后，經(jīng)1ml洗脫液洗脫后，將洗脫液過0.45μm膜，通過hplc檢測(cè)洗脫液中各物質(zhì)的濃度。

為了對(duì)比驗(yàn)證特異選擇性固相微萃取材料的特異性吸附，對(duì)非特異選擇性固相微萃取材料進(jìn)行同樣的操作，根據(jù)下列公式計(jì)算每種物質(zhì)的分配系數(shù)kd和印跡因子α，通過印跡因子來(lái)判斷特異選擇性固相微萃取材料的特異性吸附效果，結(jié)果如表2所示。

式中，qe為吸附平衡時(shí)材料的吸附量，ce為吸附平衡時(shí)萃取液的濃度。

表2特異選擇性材料與非特異選擇性材料對(duì)磺胺類藥物、呋喃妥因、四環(huán)素競(jìng)爭(zhēng)吸附結(jié)果

從表2可以看出，特異選擇性固相微萃取材料對(duì)磺胺類藥物的吸附量大于非特異選擇性固相微萃取材料，并且特異選擇性固相微萃取材料對(duì)呋喃妥因和四環(huán)素的吸附量較小，明顯低于非特異選擇性固相微萃取材料對(duì)呋喃妥因和四環(huán)素的吸附量。同時(shí)，十種磺胺類藥物在特異選擇性材料中的分配系數(shù)要明顯高于非特異選擇性材料。十種磺胺類藥物的印跡因子均大于1，而特異選擇性材料和非特異選擇性材料對(duì)呋喃妥因和四環(huán)素兩種物質(zhì)的印跡因子僅為0.14和0.12，說(shuō)明特異選擇性固相微萃取材料對(duì)十種磺胺藥物具有選擇性吸附，對(duì)兩種競(jìng)爭(zhēng)吸附物質(zhì)沒有特異性吸附。

在最優(yōu)固相微萃取條件下，得到材料對(duì)1，2，5，15和20μg/l的5ml十種磺胺藥物混合溶液的富集標(biāo)準(zhǔn)曲線。并分別取0.1，0.3，0.5，0.8和1.0mg/l的10種磺胺藥物混合工作溶液，繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。富集倍數(shù)用富集標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線斜率比值表示，結(jié)果見表3。

表3十種磺胺類藥物的富集倍數(shù)

由結(jié)果可知，該特異性吸附固相微萃取材料對(duì)十種磺胺類物質(zhì)的富集倍數(shù)均大于75，富集能力強(qiáng)，可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

在最優(yōu)的固相微萃取條件下，對(duì)超市購(gòu)買的雞蛋樣品進(jìn)行檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)有磺胺類獸藥殘留。對(duì)雞蛋樣品進(jìn)了加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，添加量為50μg/kg、20μg/kg和10μg/kg十種磺胺藥物混合標(biāo)準(zhǔn)液，用分子印跡固相微萃取材料對(duì)加標(biāo)雞蛋樣品進(jìn)行處理，測(cè)定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差以及回收率，雞蛋樣品的加標(biāo)回收率的結(jié)果見下表，加標(biāo)樣品色譜圖見圖8。

表4雞蛋樣品的加標(biāo)回收率

由上表可知，十種磺胺類藥物在雞蛋中添加回收率為65.5％-105.33％，回收率高，符合痕量物質(zhì)檢測(cè)要求。所以該方法可以用于檢測(cè)雞蛋中十種磺胺類藥物。