本發(fā)明涉及一種檢測試劑盒，特別涉及一種HPV16型E7蛋白的ELISA檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：宮頸癌是在女性中第二常見的癌癥診斷，并且在99.7％的情況下與高危人乳頭瘤病毒感染相關(guān)，全世界每年有約400000例宮頸癌，近200000人死亡。HPV有超過100種不同的分離株，已根據(jù)它們與宮頸癌或與良性宮頸病變或非典型增生的關(guān)聯(lián)性被寬泛地再分成高危和低危亞型。低危險型HPV包括HPV6、11、42、43、44等，常引起外生殖器濕疣等良性病變包括宮頸上皮內(nèi)低度病變(CINI)，高危險型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，CP8304等亞型，與宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)高度病變(CINII/III)的發(fā)生相關(guān)，尤其是HPV16和18型，其中HPV16占50％以上。人乳頭瘤病毒(HumanPapillomavirus，HPV)是一種嗜上皮性病毒，共有3個基因區(qū)組成，包括早期區(qū)(EarlyRegion，E區(qū))、晚期區(qū)(LateRegion，L區(qū))區(qū)和與非編碼區(qū)(UncodingRegion，UCR)或上游調(diào)控區(qū)(URR)。E區(qū)按順序?yàn)镋6、E7、E1、E2、E3、E4和E5共7個基因，參與病毒DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、編碼病毒蛋白、維持細(xì)胞內(nèi)病毒的高拷貝數(shù)的基因，其中E6和E7是HPV的主要致癌基因，與病毒細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能及致癌性有關(guān)。E6和E7蛋白使腫瘤阻抑蛋白p53和pRB鈍化，分別解除細(xì)胞周期控制和抑制細(xì)胞凋亡。因此，用于測定腫瘤中的HPV狀態(tài)的最佳方法是測量腫瘤細(xì)胞中的E6/E7蛋白。目前人乳頭瘤病毒(HPV)的主要檢測方法包括原位雜交，DNA直接捕捉法和各類PCR方法。上世紀(jì)90年代中期在傳統(tǒng)的PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的實(shí)時熒光定量PCR(qPCR,Real-timeQuantitativePCR)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)成為了分子診斷研究中的重要工具。但是上述方法只是在基因水平上檢測是否感染了人乳頭瘤病毒(HPV)，至于相關(guān)致癌蛋白的表達(dá)與否，實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)并不能給出準(zhǔn)確的判斷，而且該方法需要配套儀器實(shí)時熒光定量PCR儀，價格昂貴，檢測成本高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了用于檢測高危型人乳頭瘤病毒(HPV)16亞型E7致癌蛋白的ELISA檢測試劑盒。宮頸脫落細(xì)胞裂解后直接加樣，直接檢測高危型HPV相關(guān)致癌蛋白的表達(dá)與否以及表達(dá)量，從而對于高危型HPV的感染程度有了明確的判斷，方便了后續(xù)的治療。這一點(diǎn)恰恰正是目前檢測方法(包括實(shí)時熒光定量PCR技術(shù))不能媲美的。本發(fā)明試劑盒采用雙抗體夾心法，使用抗體檢測人體宮頸脫落細(xì)胞中的高危型HPV16型E7蛋白。先將宮頸脫落細(xì)胞裂解后，直接加入包被了特異性抗體的酶標(biāo)板中，經(jīng)溫育和洗滌后，加入酶標(biāo)抗體，再經(jīng)溫育和洗滌后加入底物，用酶標(biāo)儀檢測OD值。OD值與E7蛋白含量呈正相關(guān)，由此實(shí)現(xiàn)對人體宮頸脫落細(xì)胞中的HPV16型E7蛋白的定量檢測。本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：本發(fā)明提供了一種HPV16型E7蛋白檢測的酶標(biāo)板，該酶標(biāo)板包被有HPV16型E7抗體。優(yōu)選地，該酶標(biāo)板的每個微孔內(nèi)抗體的包被量為0.05～0.5μg。優(yōu)選地，所述酶標(biāo)板的制備方法，包括如下步驟：取HPV16型E7抗體，按100μL/孔將包被液(包被液：抗體0.5～5mg加入包被緩沖液1000ml；包被緩沖液為：Na2CO31.59g/L，NaHCO32.93g/L)加入微孔內(nèi)，4℃過夜(16～18h)；采用洗滌液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、Tween-200.5ml/L、proclin3000.3ml/L)進(jìn)行洗滌，300μL/孔，洗滌五次；按300μl/孔往微孔中加入封閉液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、BSA10g/L、sucrose25g/L、proclin3000.3ml/L)，37℃放置1～2h進(jìn)行封閉；在干燥房(18-26℃)抽干后，真空密封(2-8℃)，得到包被HPV16型E7抗體的微孔板，干燥保存。本發(fā)明還提供了一種HPV16型E7蛋白的ELISA檢測試劑盒，該試劑盒包括：包被有HPV16型E7抗體的酶標(biāo)板：酶標(biāo)板的每個微孔內(nèi)抗體的包被量為0.05～0.5μg；HRP標(biāo)記的HPV16型E7抗體：濃度為0.05～0.4μg/ml。進(jìn)一步，所述的試劑盒還包括人體宮頸脫落細(xì)胞裂解液。優(yōu)選地，所述的人體宮頸脫落細(xì)胞裂解液包括：0.05％～1％(體積百分比)表面活性劑；10mM～1M緩沖液；1mM～10mM蛋白酶抑制劑。(結(jié)合多次凍融可達(dá)到更加理想的裂解效果)更優(yōu)選地，所述的表面活性劑為Tween20，Triton-100或十二烷基磺酸鈉中的一種或兩種以上。所述的緩沖液為phosphate-bufferedsaline，Tris-HCL或碳酸鹽溶液，所述的蛋白酶抑制劑為cystatin，PMSF或Antipain中的一種或兩種以上。更優(yōu)選地，所述的人體宮頸脫落細(xì)胞裂解液由包括如下步驟的方法制備得到：用10mM～1M緩沖液配置0.05％～1％(體積百分比)表面活性劑；用之前加入終濃度為1mM～10mM蛋白酶抑制劑。更優(yōu)選地，所述的人體宮頸脫落細(xì)胞裂解液由包括如下步驟的方法制備得到：用50mMPBS溶液配置1％Tween20；用之前加入終濃度為5mM蛋白酶抑制劑PMSF。進(jìn)一步，所述的包被有HPV16型E7抗體的酶標(biāo)板的制備方法，包括如下步驟：取HPV16型E7抗體，按100μL/孔將包被液(包被液：抗體0.5～5mg加入包被緩沖液1000ml；包被緩沖液為：Na2CO31.59g/L，NaHCO32.93g/L)加入微孔內(nèi)，4℃過夜(16～18h)；采用洗滌液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、Tween-200.5ml/L、proclin3000.3ml/L)進(jìn)行洗滌，300μL/孔，洗滌五次；按300μl/孔往微孔中加入封閉液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、BSA10g/L、sucrose25g/L、proclin3000.3ml/L)，37℃放置1～2h進(jìn)行封閉；在干燥房(18-26℃)抽干后，真空密封(2-8℃)，得到包被HPV16型E7抗體的微孔板，干燥保存。具體地，該試劑盒的主要組成成分如下：①上述包被有HPV16型E7抗體的酶標(biāo)板：每個微孔內(nèi)抗體的包被量為0.05～0.5μg，條形微孔板(12條×8孔)，置于框架中；②HPV16型E7蛋白校準(zhǔn)品0、1、2、3、4、5：校準(zhǔn)品為凍干粉，分別加入1mlddH2O溶解，校準(zhǔn)品溶液的線性濃度分別為0、10、20、40、80、160ng/ml；③HPV16型E7蛋白質(zhì)控品1、2：質(zhì)控品為凍干粉，加入1mlddH2O溶解，濃度分別為10和80ng/ml；④HRP標(biāo)記的HPV16型E7抗體：直接使用，濃度為0.05～0.4μg/ml，1瓶，每瓶12ml；⑤上述人體宮頸脫落細(xì)胞裂解液；⑥底物溶液：單組份TMB顯色液；(購于北京索萊寶科技有限公司)⑦濃縮洗滌液(20×)：含有去污劑和防腐劑的濃縮洗滌液，用ddH2O稀釋20倍；⑧終止液：量取80mlddH2O倒入容器中，量取10.87ml濃硫酸，沿著器壁慢慢倒入水中，并不停地?cái)噭?，定容?00ml，混勻，室溫保存。⑨封口膜：孵育時密封微孔板的粘性薄膜。本發(fā)明還提供了上述試劑盒的制備方法，包括如下步驟：①制備包被HPV16型E7抗體的酶標(biāo)板取HPV16型E7抗體，按100μL/孔將包被液(包被液：抗體0.5～5mg加入包被緩沖液1000ml；包被緩沖液為：Na2CO31.59g/L，NaHCO32.93g/L)加入微孔內(nèi)，4℃過夜(16～18h)；采用洗滌液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、Tween-200.5ml/L、proclin3000.3ml/L)進(jìn)行洗滌，300μL/孔，洗滌五次；按300μl/孔往微孔中加入封閉液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、BSA10g/L、sucrose25g/L、proclin3000.3ml/L)，37℃放置1～2h進(jìn)行封閉；在干燥房(18-26℃)抽干后，真空密封(2-8℃)，得到包被HPV16型E7抗體的微孔板，干燥保存。②標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品HPV16型E7蛋白校準(zhǔn)品0、1、2、3、4、5：校準(zhǔn)品為凍干粉，分別加入1mlddH2O溶解，校準(zhǔn)品溶液的線性濃度分別為0、10、20、40、80、160ng/ml；HPV16型E7蛋白質(zhì)控品1、2：質(zhì)控品為凍干粉，加入1mlddH2O溶解，濃度分別為10和80ng/ml；③HRP標(biāo)記的HPV16型E7抗體采用過碘酸鈉法進(jìn)行標(biāo)記，之后加入HRP穩(wěn)定劑，混勻，濃度為0.05～0.4μg/ml，2-8℃保存。④人體宮頸脫落細(xì)胞裂解液用10mM～1M緩沖液配置0.05％～1％(體積百分比)表面活性劑；用之前加入終濃度為1mM～10mM蛋白酶抑制劑。所述的表面活性劑為Tween20，Triton-100或十二烷基磺酸鈉中的一種或兩種以上。所述的緩沖液為phosphate-bufferedsaline，Tris-HCL或碳酸鹽溶液，所述的蛋白酶抑制劑為cystatin，PMSF或Antipain中的一種或兩種以上。⑤濃縮洗滌液(20×)28.8gNa2HPO4·12H2O、4.8gKH2PO4、160gNaCl、4gKCl、10mlTween-20、6mlproclin300加入ddH2O，定容至1000ml，混勻，室溫保存。⑥終止液量取80mlddH2O倒入容器中，量取10.87ml濃硫酸，沿著器壁慢慢倒入水中，并不停地?cái)噭樱ㄈ葜?00ml，混勻，室溫保存。⑦底物溶液、封口膜，直接購買得到。該試劑盒的檢測方法，包括如下步驟：獲取足量的人體宮頸脫落細(xì)胞，加入裂解液中，渦旋震蕩2～10min，放入-20℃冰箱凍融1～3次，再次震蕩2～10min，離心10～30min(13000rpm)，收集上清，直接進(jìn)行檢測；①從4℃冰箱取出所需酶標(biāo)板，室溫放置15min；②每孔加入100ul校準(zhǔn)品/質(zhì)控品/樣本，混勻置于37℃孵育30～60min；③甩干孔內(nèi)液體，每孔加入300μl洗滌液，靜置孵育1min，甩干孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此重復(fù)3～5次；④每孔加入100μl酶標(biāo)抗體溶液，置于37℃孵育30～60min；⑤甩干孔內(nèi)液體，每孔加入300μl洗滌液，靜置孵育1min，甩干孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此重復(fù)3～5次；⑥每孔加入100ul底物溶液，置于37℃孵育15min；⑦每孔加入50ul終止液，混勻，置于酶標(biāo)儀讀取OD值；以校準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，采用四參數(shù)邏輯擬合法得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算待檢樣本中HPV16型E7蛋白含量。試劑盒的結(jié)果判讀本發(fā)明所具有的有益效果:某些臨床病人雖然基因水平上感染了人乳頭瘤病毒(HPV)，但是相關(guān)致癌蛋白表達(dá)量很低甚至不表達(dá)，這種情況可通過病人自身的免疫系統(tǒng)消除人乳頭瘤病毒(HPV)，無需引起恐慌以及不必要的治療，減輕患者精神壓力以及經(jīng)濟(jì)壓力。基于此，本發(fā)明直接檢測高危型HPV相關(guān)致癌蛋白的表達(dá)與否以及表達(dá)量，從而對于高危型HPV的感染程度有了明確的判斷，方便了后續(xù)的治療。該發(fā)明與目前基因水平檢測方法形成互補(bǔ)，使得檢測結(jié)果愈加精確，治療方案愈加明確，患者早日康復(fù)。同時該方法只需要常規(guī)的酶標(biāo)儀，檢測成本低，可作為宮頸癌篩查的首選方法。附圖說明圖1是實(shí)施例4以校準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，采用四參數(shù)邏輯擬合法得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1、包被HPV16型E7抗體的酶標(biāo)板的制備方法，包括如下步驟：取HPV16型E7抗體，按100μL/孔將包被液(包被液：抗體5mg加入包被緩沖液1000ml；包被緩沖液為：Na2CO31.59g/L，NaHCO32.93g/L)加入微孔內(nèi)，4℃過夜(18h)；采用洗滌液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、Tween-200.5ml/L、proclin3000.3ml/L)進(jìn)行洗滌，300μL/孔，洗滌五次；按300μl/孔往微孔中加入封閉液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、BSA10g/L、sucrose25g/L、proclin3000.3ml/L)，37℃放置2h進(jìn)行封閉；在干燥房(26℃)抽干后，真空密封(4℃)，得到包被HPV16型E7抗體的微孔板，干燥保存。實(shí)施例2、配置人體宮頸脫落細(xì)胞裂解液以及裂解宮頸樣本用50mMPBS溶液配置1％Tween20；用之前加入終濃度為5mM蛋白酶抑制劑PMSF。將500ul裂解液加入宮頸脫落細(xì)胞收集管中，渦旋震蕩2min，置于-20℃冰箱10min，之后置于37℃烘箱2min，再次震蕩，離心(20min，13000rpm，4℃)，收集上清進(jìn)行檢測。實(shí)施例3一種HPV16型E7蛋白的ELISA檢測試劑盒的制備方法，①包被有HPV16型E7抗體的酶標(biāo)板：每個微孔內(nèi)抗體的包被量為0.5μg，條形微孔板(12條×8孔)，置于框架中；制備方法同實(shí)施例1。②HPV16型E7蛋白校準(zhǔn)品0、1、2、3、4、5：校準(zhǔn)品為凍干粉，分別加入1mlddH2O溶解，校準(zhǔn)品溶液的線性濃度分別為0、10、20、40、80、160ng/ml；③HPV16型E7蛋白質(zhì)控品1、2：質(zhì)控品為凍干粉，加入1mlddH2O溶解，濃度分別為10和80ng/ml；④HRP標(biāo)記的HPV16型E7抗體：采用過碘酸鈉法進(jìn)行標(biāo)記，之后加入HRP穩(wěn)定劑，混勻，2-8℃保存，濃度為0.4μg/ml，1瓶，每瓶12ml；⑤人體宮頸脫落細(xì)胞裂解液；制備方法同實(shí)施例2。⑥底物溶液：單組份TMB顯色液；(購于北京索萊寶科技有限公司)⑦濃縮洗滌液(20×)：28.8gNa2HPO4·12H2O、4.8gKH2PO4、160gNaCl、4gKCl、10mlTween-20、6mlproclin300加入ddH2O，定容至1000ml，混勻，室溫保存。⑧終止液：量取80mlddH2O倒入容器中，量取10.87ml濃硫酸，沿著器壁慢慢倒入水中，并不停地?cái)噭?，定容?00ml，混勻，室溫保存。⑨封口膜：孵育時密封微孔板的粘性薄膜。實(shí)施例4、檢測某一宮頸樣本酶標(biāo)板的包被以及宮頸樣本的裂解同實(shí)施例1～2。①從4℃冰箱取出所需酶標(biāo)板，室溫放置15min；②每孔加入100ul校準(zhǔn)品/質(zhì)控品/樣本，混勻置于37℃孵育60min；③甩干孔內(nèi)液體，每孔加入300μl洗滌液，靜置孵育1min，甩干孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此重復(fù)5次；④每孔加入100μl酶標(biāo)抗體溶液，置于37℃孵育60min；⑤甩干孔內(nèi)液體，每孔加入300μl洗滌液，靜置孵育1min，甩干孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此重復(fù)5次；⑥每孔加入100ul底物溶液，置于37℃孵育15min；⑦每孔加入50ul終止液，混勻，置于酶標(biāo)儀讀取OD值；以校準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，采用四參數(shù)邏輯擬合法得到標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待檢樣本中HPV16型E7蛋白含量為43.47ng/ml，按照結(jié)果判讀，該樣本為陽性，患者需要積極治療。用本發(fā)明試劑盒(如實(shí)施例3的檢測試劑盒)檢測一部分健康人宮頸脫落細(xì)胞，檢測數(shù)據(jù)結(jié)果如下；表一：檢測正常人宮頸脫落細(xì)胞數(shù)據(jù)結(jié)果表二：檢測病人宮頸脫落細(xì)胞數(shù)據(jù)結(jié)果數(shù)據(jù)分析1、根據(jù)正常人檢測值，計(jì)算出平均值，標(biāo)準(zhǔn)方差，Cutoff值。分別將83例正常人宮頸脫落細(xì)胞檢測結(jié)果取平均數(shù)，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)方差SD，本試劑盒在確定Cutoff值時選擇正常人平均值加上兩倍的標(biāo)準(zhǔn)方差作為HPV16E7蛋白表達(dá)陰陽性的判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果如下：Cutoff計(jì)算公式為：cutoff＝平均值+2*SD標(biāo)準(zhǔn)方差表三：檢測數(shù)據(jù)表一統(tǒng)計(jì)平均值4.06SD標(biāo)準(zhǔn)方差5.48Cutoff15.02ng/ml2、通過Cutoff值，判斷待檢樣本HPV16E7蛋白表達(dá)的陰陽性，超過這個Cutoff值的即認(rèn)為是陽性，即認(rèn)為表達(dá)了HPV16E7蛋白，同時與病理資料對比。3、表三：根據(jù)Cutoff值判斷表二病人宮頸脫落細(xì)胞診斷結(jié)果(“+”表示檢測結(jié)果陽性；“-”表示檢測結(jié)果陰性)表四：根據(jù)表三病人宮頸脫落細(xì)胞診斷結(jié)果陰陽性制定準(zhǔn)確率比例表在表二實(shí)驗(yàn)中所檢測的病人宮頸脫落細(xì)胞共計(jì)19例，試劑盒HPV16E7蛋白檢測結(jié)果為陽性的為14例，診斷靈敏度高達(dá)78.9％；其中針對CINII以上病例樣本，診斷靈敏度高達(dá)80％。當(dāng)前第1頁1 2 3