本發(fā)明涉及一種檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒（HCMV）IgG和IgM抗體的ELISA檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus， HCMV）可通過口腔、生殖道、胎盤、授乳以及輸血或器官移植等多途徑傳播。人群感染HCMV的顯著特點(diǎn)是感染率高，正常成人HCMV抗體陽性率為76.7%－95.8%，我國也是HCMV感染高度流行國家之一。
HCMV初次感染可無明顯癥狀，但病毒從此長期潛伏體內(nèi)。當(dāng)機(jī)體免疫功能低下時(shí)，潛伏病毒開始復(fù)制并大量增殖，繼發(fā)活動(dòng)性感染并表現(xiàn)多種臨床癥狀。HCMV感染是導(dǎo)致出生缺陷的重要因素之一，并且有研究顯示HCMV感染與糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化及一些惡性腫的發(fā)病密切相關(guān)。臨床活動(dòng)性HCMV感染多見于孕婦，新生兒、輸血患者、惡性腫瘤和艾滋病患者以及器官移植等使用免疫抑制劑的患者。孕婦活動(dòng)性感染可通過胎盤、產(chǎn)道或授乳傳給胎兒，導(dǎo)致流產(chǎn)，死胎，胎兒形態(tài)畸形，器官功能障礙。先天感染的新生兒出生時(shí)可伴有黃疸、瘀斑、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、小頭畸形等，而無癥狀的部分新生兒，隨著發(fā)育才逐漸被發(fā)現(xiàn)聽覺、視力低下，智力發(fā)育遲緩，運(yùn)動(dòng)障礙等。在惡性腫瘤、艾滋病、器官移植等免疫功能減弱或受抑制的患者HCMV的活動(dòng)性感染常并發(fā)間質(zhì)性肺炎、視網(wǎng)膜炎、食管炎、結(jié)腸炎和腦膜腦炎等多器官臟器損害的各種臨床綜合征，是患者致死或移植術(shù)失敗的重要原因。
無論是初次感染還是潛伏病毒的繼發(fā)活動(dòng)性感染，病毒大量復(fù)制、出現(xiàn)癥狀的早期機(jī)體會(huì)產(chǎn)生IgM型抗體。IgM相對(duì)于IgG的特點(diǎn)是產(chǎn)生早、消失快。所以IgM的檢出代表近期感染、機(jī)體可能尚處于病毒大量復(fù)制狀態(tài)。加之IgM的檢測(cè)多采用簡便快速價(jià)格低廉的ELISA方法，所以盡管存在被檢出的時(shí)間段較短，依然是臨床常用的初步判斷感染與否的檢測(cè)方法。而目前檢測(cè)HCMV IgM的試劑多以HCMV全病毒裂解蛋白作為包被抗原。其抗原成分復(fù)雜且潛在宿主細(xì)胞蛋白污染的可能，也潛在結(jié)合皰疹病毒科其他病毒抗體產(chǎn)生假陽性信號(hào)的可能，并且試劑的制作過程因需要培養(yǎng)病毒而操作繁瑣。少數(shù)HCMV IgM抗體檢測(cè)試劑雖以HCMV的重組蛋白為包被抗原，試劑制作經(jīng)濟(jì)簡便，但是試劑的穩(wěn)定性較差，敏感性和特異性也有待提高。所以研制制作過程簡單、費(fèi)用低廉、敏感性和特異性更好的HCMV IgM抗體檢測(cè)試劑依然具有實(shí)際意義。
檢測(cè)IgG抗體了解人群感染率，對(duì)HCMV相關(guān)疾病的預(yù)防、管理控制及相關(guān)政策的制定具有重要意義。而明確個(gè)體HCMV已感染狀態(tài)則利于臨床確定個(gè)體治療方案，如AIDS及器官移植術(shù)患者，需要檢測(cè)HCMV IgG抗體，從而確定是否需要跟蹤其IgM抗體水平，以便及時(shí)抗HCMV治療。所以HCMV IgG抗體的檢測(cè)雖然只能代表曾感染、體內(nèi)潛伏有HCMV，并非病毒活動(dòng)性感染的指證，但是仍然具有市場(chǎng)需求。目前市售檢測(cè)HCMV IgG抗體的試劑多以HCMV全病毒裂解物作為包被抗原，其抗原成分復(fù)雜且潛在宿主細(xì)胞蛋白污染的可能，也潛在結(jié)合皰疹病毒科其他病毒抗體產(chǎn)生假陽性信號(hào)的可能，并且試劑的制作過程因需要培養(yǎng)病毒而操作繁瑣。少數(shù)HCMV IgG抗體檢測(cè)試劑則以HCMV的重組蛋白為包被抗原，這種試劑制作經(jīng)濟(jì)簡便但是試劑的穩(wěn)定性較差，敏感性和特異性也有待提高，而進(jìn)口的此類試劑價(jià)格過高。
綜上所述，需要一種制作過程簡單、費(fèi)用低廉、敏感性和特異性更好的HCMV IgG和HCMV IgM抗體檢測(cè)試劑。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種基于PP65蛋白檢測(cè)HCMV IgG和IgM的試劑盒，至少具有特異性、敏感性、穩(wěn)定性更高的特點(diǎn)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種基于PP65蛋白檢測(cè)HCMV IgG和IgM的試劑盒，包括
——包被有重組HCMV PP65322-561蛋白抗原的酶標(biāo)板；
——酶標(biāo)二抗，包括用于檢測(cè)IgG的HRP-抗人IgG抗體和用于檢測(cè)IgM的HRP-抗人IgM抗體。
作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述的包被有重組HCMV PP65322-561蛋白抗原的酶標(biāo)板的制備方法包括步驟：原核表達(dá)并純化HCMV被膜磷蛋白PP65322-561；包被液稀釋重組PP65322-561蛋白抗原為10μg/ml，每孔100μl加入酶標(biāo)板中，37℃ 1小時(shí)，再4℃包被12~24小時(shí)；棄去孔內(nèi)液體，PBST洗后拍干，使用含1%BSA的PBS封閉液每孔100μl， 37℃封閉2h，PBST洗后拍干。
上述試劑盒可用于檢測(cè)HCMV IgG抗體和HCMV IgM抗體。
作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述的HRP-抗人IgG抗體選自HRP-羊抗人IgG抗體、HRP-兔抗人IgG抗體、HRP-鼠抗人γ鏈抗體中的一種。所述的HRP-抗人IgM抗體選自HRP-羊抗人IgM抗體、HRP-兔抗人IgM抗體、HRP-鼠抗人μ鏈抗體中的一種。
含HCMV強(qiáng)免疫原性抗原表位的重組蛋白可代替全病毒用于HCMV特異性抗體的檢測(cè)。HCMV PP65蛋白是HCMV眾多結(jié)構(gòu)蛋白中可以特異性激發(fā)B 細(xì)胞、細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞( CTL)和輔助性 T 細(xì)胞( Th) 免疫的主要靶蛋白，不同HCMV病毒株中, HCMV pp65基因高度保守，本發(fā)明所用PP65332～561片段是富含T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位的PP65第322到561位氨基酸序列。PP65蛋白是HCMV被膜磷蛋白而非糖基化蛋白，無需真核表達(dá)的糖基化和折疊過程，在原核細(xì)胞表達(dá)就可獲得高免疫活性蛋白片段。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒IgG抗體的方法，采用了上述試劑盒。
作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒IgG抗體的方法包括步驟：稀釋的待檢血清，于酶標(biāo)板孔內(nèi)加樣37℃孵育，洗板；加酶標(biāo)二抗HRP-抗人IgG抗體37℃孵育，洗板；加底物顯色液，室溫顯色；加終止液，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450值。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒IgM抗體的方法，采用了上述試劑盒。
作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述的檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒IgM抗體的方法包括步驟：將IgG-RF吸附劑與待測(cè)血清混勻，室溫放置；稀釋經(jīng)吸附劑處理過的待測(cè)血清，于酶標(biāo)板孔內(nèi)加樣，37℃孵育后PBST洗板，拍干；加酶標(biāo)二抗HRP-抗人IgM抗體 37℃孵育，洗板；加底物顯色液，室溫顯色；加終止液，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450值。待測(cè)血清樣品中針對(duì)包被抗原的特異性IgM常常與特異性IgG同時(shí)存在，后者會(huì)干擾IgM的測(cè)定。同時(shí)，類風(fēng)濕因子（RF）也會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果。因此在血清樣品測(cè)定前，須加入IgG-RF吸附劑以消除IgG、RF干擾。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)探明將IgG-RF吸附劑與待測(cè)血清1:1混勻，室溫放置30 min可去除干擾。
本發(fā)明利用重組PP65332～561蛋白建立了檢測(cè)HCMV IgG抗體和HCMV IgM抗體的間接ELISA檢測(cè)方法，證明試劑具有較好的特異性、敏感性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性，且試劑制作過程簡單、標(biāo)準(zhǔn)易于控制。上述檢測(cè)方法僅獲得中間結(jié)果，該結(jié)果與疾病的診斷或健康狀況無直接必然聯(lián)系。對(duì)于IgG檢測(cè)方法，陽性僅能說明曾經(jīng)感染過，主要用于流行病學(xué)調(diào)查，以利于疾控部門制定政策參考。對(duì)于IgM檢測(cè)方法，如果是陽性，還需要結(jié)合其他必要指標(biāo)才能確定是否處于感染狀態(tài)，檢測(cè)群體IgM陽性率也常用于人群近期感染現(xiàn)狀的流行病學(xué)調(diào)查。
以廣為應(yīng)用的、業(yè)界認(rèn)為敏感性和特異性均較好的意大利德賽公司檢測(cè)試劑作為相對(duì)參考試劑，檢測(cè)結(jié)果表明，檢測(cè)HCMV IgG抗體與其符合率為95%，檢測(cè)HCMV IgM抗體與其符合率為81%，且本發(fā)明的陽性檢出率高于此試劑，敏感性更高。為臨床快速檢測(cè)HCMV IgG和HCMV IgM抗體，明確既往感染和潛伏感染提供了一種新選擇，也為人群HCMV感染狀態(tài)的流行病學(xué)調(diào)查和常規(guī)監(jiān)測(cè)提供了新的備選方案。
具體實(shí)施方式
需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請(qǐng)中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互組合。下面將參考具體實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。
實(shí)施例1
基于PP65 322-561蛋白檢測(cè)IgG的試劑，包括包被有重組HCMV PP65322-561蛋白抗原的酶標(biāo)板、HRP-抗人IgG、PBST洗滌液、底物顯色液和終止液。
其中，HCMV PP65322-561蛋白抗原的酶標(biāo)板的制備方法是原核表達(dá)并純化HCMV被膜磷蛋白PP65322-561；包被液稀釋重組PP65322-561蛋白抗原為10μg/ml，每孔100μl加入酶標(biāo)板中，37℃ 1小時(shí)，再4℃包被12~24小時(shí)；棄去孔內(nèi)液體，PBST洗3次，拍干，使用含1%BSA的PBS封閉液每孔100μl， 37℃封閉2h，PBST洗3次，拍干。
PBST洗滌液的配方為：0.15M KH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8.0g， KCl 0.2g，0.05％ Tween-20 0.5ml，加蒸餾水至40ml；
底物顯色液是在臨用前由底物液A和底物緩沖液B各一半混合而成。底物液A主要成份是四甲基聯(lián)苯胺（TMB)：TMB 20mg，無水乙醇10ml，加蒸餾水至100ml；底物緩沖液B主要成份是PH5.0的磷酸檸檬酸：0.2M Na2HPO4 25.7ml，0.1M 檸檬酸24.3ml，加蒸餾水至100ml；
終止液主要成份是2M H2SO4：蒸餾水178.3ml，逐滴加入98％的濃硫酸21.7ml；
封板膜為與酶標(biāo)板的板面大小一致的透明塑料膜。
以上所述的HRP-抗人IgG抗體選自HRP-羊抗人IgG抗體、HRP-兔抗人IgG抗體、HRP-鼠抗人γ鏈抗體中的一種，但不限于此。
實(shí)施例2
基于PP65 322-561蛋白檢測(cè)IgM的試劑盒，包括包被有重組HCMV PP65322-561蛋白抗原的酶標(biāo)板、HRP-抗人IgM、PBST洗滌液、底物顯色液和終止液。
其中，HCMV PP65322-561蛋白抗原的酶標(biāo)板的制備方法是原核表達(dá)并純化HCMV被膜磷蛋白PP65322-561；包被液稀釋重組PP65322-561蛋白抗原為10μg/ml，每孔100μl加入酶標(biāo)板中，37℃ 1小時(shí)，再4℃包被12~24小時(shí)；棄去孔內(nèi)液體，PBST洗3次，拍干，使用含1%BSA的PBS封閉液每孔100μl， 37℃封閉2h，PBST洗3次，拍干。
PBST洗滌液的配方為：0.15M KH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8.0g， KCl 0.2g，0.05％ Tween-20 0.5ml，加蒸餾水至40ml；
底物顯色液是在臨用前由底物液A和底物緩沖液B各一半混合而成。底物液A主要成份是四甲基聯(lián)苯胺（TMB)：TMB 20mg，無水乙醇10ml，加蒸餾水至100ml；底物緩沖液B主要成份是PH5.0的磷酸檸檬酸：0.2M Na2HPO4 25.7ml，0.1M 檸檬酸24.3ml，加蒸餾水至100ml；
終止液主要成份是2M H2SO4：蒸餾水178.3ml，逐滴加入98％的濃硫酸21.7ml；
封板膜為與酶標(biāo)板的板面大小一致的透明塑料膜。
以上所述的HRP-抗人IgM抗體選自HRP-羊抗人IgG抗體、HRP-兔抗人IgG抗體、HRP-鼠抗人μ鏈抗體中的一種，但不限于此。
實(shí)施例3
人巨細(xì)胞病毒IgG抗體的檢測(cè)方法，該方法采用實(shí)施例1提供的試劑。用封閉液1:400稀釋的待檢血清，于酶標(biāo)板孔內(nèi)加樣，每孔100μl，37℃孵育1h后PBST洗板3次，拍干；加封閉液1:4000稀釋的HRP-羊抗人IgG，每孔100μl，37℃1h，PBST洗板3次；加底物顯色液每孔100μl，室溫顯色15min；加終止液50μl，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450值。
本實(shí)施例與意大利德塞公司HCMV-IgG ELISA試劑分別對(duì)100份樣品的檢測(cè)結(jié)果見下表。分別檢出89例和86例陽性，陽性率分別為89%和86%。兩種試劑的符合率為95%。
本實(shí)施例對(duì)HSV-Ⅰ型、HSV-Ⅱ型以及EBV IgG陽性血清的檢測(cè)結(jié)果顯示OD450均值分別為0.097、0.084、0.101，均小于臨界值0.135，證實(shí)無交叉反應(yīng)，排除了自制試劑非特異結(jié)合皰疹病毒科其他病毒抗體的可能。用PP65 McAb對(duì)PP65322-561蛋白片段Western Blot的鑒定結(jié)果也說明自制試劑具有良好的特異性。
本實(shí)施例批內(nèi)變異系數(shù)介于2.1%～5.1%，批間變異系數(shù)介于3.4%～6.4%，均小于10%，說明檢測(cè)體系穩(wěn)定，穩(wěn)定性和可重復(fù)性良好。
實(shí)施例4
人巨細(xì)胞病毒IgM抗體的檢測(cè)方法，該方法采用實(shí)施例2提供的試劑。將IgG-RF吸附劑與待測(cè)血清1:1混勻，室溫放置30 min；1:200稀釋經(jīng)吸附劑處理過的待測(cè)血清，于酶標(biāo)板孔內(nèi)加樣，每孔100μl，37℃孵育1h后PBST洗板3次，拍干；加封閉液1:2000稀釋的HRP-羊抗人IgM每孔100μl，37℃孵育1h，洗板3次；加底物顯色液每孔100μl，室溫顯色15min；加終止液每孔50μl，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450值。
在血清樣品測(cè)定前，須加入IgG-RF吸附劑以消除IgG、RF干擾。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)探明將IgG-RF吸附劑與待測(cè)血清1:1混勻，室溫放置30 min可去除干擾。另外，利用β-巰基乙醇解聚IgM多聚體結(jié)構(gòu)的功能，將等量0.2 mol/L的β-巰基乙醇37 ℃處理待測(cè)樣品1 h，發(fā)現(xiàn)5份HCMV IgM抗體陽性血清檢測(cè)結(jié)果全部轉(zhuǎn)為陰性，而1份僅HCVM IgG抗體陽性的血清無變化，說明本發(fā)明所測(cè)抗體為IgM。
本實(shí)施例對(duì)HSV-Ⅰ型、EBV IgM陽性血清的檢測(cè)結(jié)果顯示OD450均小于臨界值0.179，證實(shí)本發(fā)明與HSV-1型、EBV IgM均無交叉反應(yīng)，特異性良好。
精密度分析結(jié)果顯示：批內(nèi)變異系數(shù)為5.3%～8.3%，批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)為2.3%～7.9%，均小于10%，說明檢測(cè)體系穩(wěn)定，有較好的可重復(fù)性。
本實(shí)施例與意大利德塞公司HCMV-IgM ELISA試劑分別對(duì)100份臨床疑似HCMV感染血清的檢測(cè)結(jié)果見下表。分別檢出58例和51例陽性，陽性率分別為58%和51%，本實(shí)施例敏感性高于德賽公司試劑。兩種試劑的符合率為81%。
實(shí)施例5
人巨細(xì)胞病毒IgG抗體的檢測(cè)方法，該方法采用實(shí)施例1提供的試劑。用封閉液1:400稀釋的待檢血清，于酶標(biāo)板孔內(nèi)加樣，每孔100μl，37℃孵育1h后PBST洗板3次，拍干；加封閉液1:4000稀釋的HRP-兔抗人IgG，每孔100μl，37℃1h，PBST洗板3次；加底物顯色液每孔100μl，室溫顯色15min；加終止液50μl，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450值。
實(shí)施例6
人巨細(xì)胞病毒IgM抗體的檢測(cè)方法，該方法采用實(shí)施例2提供的試劑。將IgG-RF吸附劑與待測(cè)血清1:1混勻，室溫放置30 min；1:200稀釋經(jīng)吸附劑處理過的待測(cè)血清，于酶標(biāo)板孔內(nèi)加樣，每孔100μl，37℃孵育1h后PBST洗板3次，拍干；加封閉液1:2000稀釋的HRP-兔抗人IgM每孔100μl，37℃孵育1h，洗板3次；加底物顯色液每孔100μl，室溫顯色15min；加終止液每孔50μl，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450值。
同上檢測(cè)方法，加HRP-鼠抗人γ鏈抗體檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒IgG抗體，加HRP-鼠抗人μ鏈抗體檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒IgM抗體。本發(fā)明要求保護(hù)的范圍不限于以上具體實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，本發(fā)明可以有多種變形和更改，凡在本發(fā)明的構(gòu)思與原則之內(nèi)所作的任何修改、改進(jìn)和等同替換都應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。