本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及豬偽狂犬病病毒的檢測(cè)試紙。

背景技術(shù)：

豬偽狂犬病(Pseudorabies)又稱(chēng)Aujeszky氏病，是由皰疹病毒科(Herpesviridae)α亞科中的豬皰疹病毒I型(Suid herpes virus I)所引起的豬、牛、羊等多種家畜及野生動(dòng)物的一種以發(fā)熱、奇癢(除豬外)、腦脊髓炎為主要癥狀的急性傳染病。豬是該病的主要貯存宿主和傳染源。豬偽狂犬病病毒可以感染不同年齡段的豬，但以妊娠母豬和哺乳仔豬感染最為嚴(yán)重：導(dǎo)致妊娠母豬流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎；育肥豬感染豬偽狂犬病病毒時(shí)表現(xiàn)為呼吸道癥狀，無(wú)并發(fā)癥時(shí)死亡率低；哺乳仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、麻痹、衰竭死亡，死亡率幾乎高達(dá)100％，斷奶仔豬發(fā)病率約40％，死亡率可達(dá)20％。

預(yù)防豬偽狂犬病主要通過(guò)豬偽狂犬病病毒gE基因缺失弱毒疫苗進(jìn)行，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)在被免疫的豬血清中不能檢測(cè)到針對(duì)gE蛋白的抗體，這一差異為利用血清進(jìn)行偽狂犬野生毒株感染和gE基因缺失疫苗免疫接種進(jìn)行鑒別診斷提供條件。

然而，此種方法必須在實(shí)驗(yàn)室中完成，所用時(shí)間長(zhǎng)，費(fèi)用高，并且不能鑒別出未免疫、無(wú)感染的抗體陰性豬。而臨床上病情復(fù)雜，疫苗免疫豬、野毒株感染豬、無(wú)免疫無(wú)感染陰性豬常呈雜居狀態(tài)，臨床上迫切需要提供一種快速、方便、特異性高、靈敏度高、現(xiàn)場(chǎng)可用的檢測(cè)方法。

此外，現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)于豬偽狂犬病病毒疫苗的免疫效果的檢測(cè)需要耗時(shí)較長(zhǎng)的中和效價(jià)測(cè)定過(guò)程，臨床上存在簡(jiǎn)便的、快速的檢測(cè)豬偽狂犬病病毒活疫苗免疫效果和活疫苗質(zhì)量檢測(cè)的迫切需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種豬偽狂犬病病毒的檢測(cè)試紙，其中，所述檢測(cè)試紙硝酸纖維素檢測(cè)區(qū)5包括固定有豬偽狂犬病毒gD蛋白的疫苗毒株檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)。

本發(fā)明的豬偽狂犬病病毒的檢測(cè)試紙的gD蛋白對(duì)于檢測(cè)樣品中g(shù)D抗體的檢測(cè)結(jié)果與中和抗體效價(jià)、攻毒保護(hù)結(jié)果之間保持一致，本發(fā)明的檢測(cè)試紙能用于評(píng)價(jià)豬偽狂犬病活疫苗的免疫效果；同時(shí)還能檢測(cè)豬偽狂犬病活疫苗質(zhì)量。

本發(fā)明提供了一種豬偽狂犬病病毒的檢測(cè)試紙，其中，所述檢測(cè)試紙硝酸纖維素檢測(cè)區(qū)5包括固定有豬偽狂犬病毒gE蛋白的野毒株檢測(cè)線(xiàn)、固定有豬偽狂犬病毒gD蛋白的疫苗毒株檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)。

本發(fā)明的豬偽狂犬病病毒的檢測(cè)試紙能夠在臨床上鑒別是否為未免疫、無(wú)感染的陰性豬；若非陰性豬，鑒別是否為野毒株感染或是疫苗免疫豬；若為疫苗免疫豬，鑒別抗體水平能否抵抗野毒株感染。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，使用本發(fā)明的檢測(cè)試紙檢測(cè)后，能夠幫助判斷豬只是否淘汰、隔離及免疫。本發(fā)明的檢測(cè)試紙?zhí)禺?、敏感、快捷、?jiǎn)便，易在生產(chǎn)實(shí)踐中推廣應(yīng)用。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供所述豬偽狂犬病病毒檢測(cè)試紙的制備方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供所述檢測(cè)試紙?jiān)跈z測(cè)豬偽狂犬病病毒gE蛋白抗體中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供所述檢測(cè)試紙?jiān)跈z測(cè)豬偽狂犬病病毒gD蛋白抗體中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供所述檢測(cè)試紙?jiān)谟糜诜窃\斷目的的豬偽狂犬病病毒檢測(cè)中的應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明檢測(cè)試紙一種實(shí)施方式的主視圖；

圖2為本發(fā)明檢測(cè)試紙一種實(shí)施方式的俯視圖。

附圖標(biāo)記：

支撐用不吸水PVC底板1、吸水墊2、樣品墊3、金標(biāo)墊4、硝酸纖維素檢測(cè)區(qū)5、固定有豬偽狂犬病毒gE蛋白的野毒株檢測(cè)線(xiàn)6、固定有豬偽狂犬病毒gD蛋白的疫苗毒株檢測(cè)線(xiàn)7、固定有金黃色葡萄球菌SPA的質(zhì)控線(xiàn)8。

具體實(shí)施方式

以下，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明。

本發(fā)明涉及一種豬偽狂犬病病毒的檢測(cè)試紙，包括硝酸纖維素檢測(cè)區(qū)5和金標(biāo)墊4，其中，所述檢測(cè)試紙硝酸纖維素檢測(cè)區(qū)5包括固定有豬偽狂犬病毒gD蛋白的疫苗毒株檢測(cè)線(xiàn)7以及固定有金黃色葡萄球菌SPA的質(zhì)控線(xiàn)8；所述金標(biāo)墊4吸附膠體金標(biāo)記的抗豬IgG的多克隆抗體；當(dāng)檢測(cè)樣品在遷移過(guò)所述金標(biāo)墊4以后，其能向硝酸纖維素檢測(cè)區(qū)5遷移并進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的豬偽狂犬病病毒的檢測(cè)試紙的gD蛋白對(duì)于檢測(cè)樣品中g(shù)D抗體水平的檢測(cè)結(jié)果與中和抗體效價(jià)、攻毒保護(hù)結(jié)果之間保持一致，本發(fā)明的檢測(cè)試紙能用于評(píng)價(jià)豬偽狂犬病活疫苗的免疫效果；同時(shí)能檢測(cè)豬偽狂犬病活疫苗質(zhì)量。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的檢測(cè)試紙中，所述檢測(cè)試紙硝酸纖維素檢測(cè)區(qū)5進(jìn)一步包括固定有豬偽狂犬病毒gE蛋白的野毒株檢測(cè)線(xiàn)6。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的檢測(cè)試紙中，所述固定的豬偽狂犬病毒gD蛋白為編碼序列SEQ.ID.NO.1的蛋白。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的檢測(cè)試紙中，所述固定的豬偽狂犬病毒gD蛋白為序列SEQ.ID.NO.3編碼的蛋白。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的檢測(cè)試紙中，所述檢測(cè)試紙還包括樣品墊3，用于添加所述檢測(cè)樣品；以及吸水墊2，所述吸水墊2能促進(jìn)所述檢測(cè)樣品經(jīng)由樣品墊3、金標(biāo)墊4、硝酸纖維素檢測(cè)區(qū)5向吸水墊2遷移；所述樣品墊3、金標(biāo)墊4與所述吸水墊2分別位于所述硝酸纖維素檢測(cè)區(qū)5的兩端。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的檢測(cè)試紙由支撐板1，金標(biāo)墊4，硝酸纖維素檢測(cè)區(qū)5和吸水墊2構(gòu)成，金標(biāo)墊4吸附有膠體金標(biāo)記兔抗豬IgG多克隆抗體，硝酸纖維素檢測(cè)區(qū)5上印跡有野毒株檢測(cè)線(xiàn)6、疫苗毒株檢測(cè)線(xiàn)7和質(zhì)控線(xiàn)8的硝酸纖維素膜，由樣品端至手柄端的排列為野毒株感染檢測(cè)線(xiàn)6/疫苗毒株感染檢測(cè)線(xiàn)7/質(zhì)控線(xiàn)8。

鑒別檢測(cè)時(shí)，當(dāng)有豬偽狂犬野毒株感染，在硝酸纖維素檢測(cè)區(qū)5顯現(xiàn)野毒株檢測(cè)線(xiàn)6，，疫苗毒株檢測(cè)線(xiàn)7和質(zhì)控8三條紅色條帶；當(dāng)豬偽狂犬疫苗毒株免疫，在硝酸纖維素檢測(cè)區(qū)5顯現(xiàn)疫苗毒株感染檢測(cè)線(xiàn)7和質(zhì)控線(xiàn)8二條紅色條帶；當(dāng)豬偽狂犬野毒株和疫苗毒株均未感染，硝酸纖維素檢測(cè)區(qū)5只顯現(xiàn)質(zhì)控線(xiàn)8一條紅色條帶。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的檢測(cè)試紙中，所述金標(biāo)墊4上吸附的膠體金標(biāo)記的抗豬IgG的多克隆抗體包括兔抗豬IgG的多克隆抗體、或羊抗豬IgG的多克隆抗體、或鼠抗豬IgG的多克隆抗體、或馬抗豬IgG的多克隆抗體。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的檢測(cè)試紙中，所述固定的豬偽狂犬病毒gE蛋白為編碼序列SEQ.ID.NO.2的蛋白。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的檢測(cè)試紙中，所述固定的豬偽狂犬病毒gE蛋白為序列SEQ.ID.NO.4編碼的蛋白。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的檢測(cè)試紙中，所述檢測(cè)線(xiàn)6、7與質(zhì)控線(xiàn)8在所述硝酸纖維素檢測(cè)區(qū)5上依次按照從由樣品墊3向吸水墊2的方向分布。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的檢測(cè)試紙中，所述檢測(cè)線(xiàn)6、7與質(zhì)控線(xiàn)8任何兩條檢測(cè)線(xiàn)之間間隔距離≥3mm。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的檢測(cè)試紙中，所述檢測(cè)線(xiàn)6、7與質(zhì)控線(xiàn)8任何兩條檢測(cè)線(xiàn)之間間隔距離≥5mm。

本發(fā)明還涉及所述檢測(cè)試紙?jiān)谟糜诜窃\斷目的的豬偽狂犬病病毒檢測(cè)中的應(yīng)用；其中，所述非診斷目的的豬偽狂犬病病毒檢測(cè)包括流行病學(xué)分析、對(duì)離體組織進(jìn)行定性和定量豬偽狂犬病病毒的檢測(cè)、國(guó)際生豬貿(mào)易、進(jìn)出口檢疫檢驗(yàn)以及豬偽狂犬病活疫苗質(zhì)量控制方面的應(yīng)用。

本發(fā)明還涉及制備所述豬偽狂犬病病毒的檢測(cè)試紙的方法，所述方法包括：步驟(1)，表達(dá)gD蛋白、gE蛋白，制備金黃色葡萄球菌SPA和兔抗豬IgG多克隆抗體，并使用膠體金標(biāo)記所述制備的兔抗豬IgG多克隆抗體；步驟(2)，將所述步驟(1)中制備的gD蛋白、gE蛋白、金黃色葡萄球菌SPA，分別固定在硝酸纖維素膜檢測(cè)區(qū)5的野毒株檢測(cè)線(xiàn)6、疫苗毒株檢測(cè)線(xiàn)7以及質(zhì)控線(xiàn)8上，將所述制備的膠體金標(biāo)記兔抗豬IgG多克隆抗體吸附在金標(biāo)墊4上；以及步驟(3)，依次設(shè)置用于添加所述檢測(cè)樣品的樣品墊3、金標(biāo)墊4、硝酸纖維素膜檢測(cè)區(qū)5以及吸水墊2。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述豬偽狂犬病病毒的檢測(cè)試紙固定在支持物1上。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述豬偽狂犬病病毒的檢測(cè)試紙的方法步驟(2)中，將所述步驟(1)中表達(dá)的gD蛋白、gE蛋白和制備的金黃色葡萄球菌SPA分別調(diào)節(jié)濃度為0.55mg/ml、1.0mg/ml和3.0mg/ml，然后將所述調(diào)節(jié)濃度的gD蛋白、gE蛋白和金黃色葡萄球菌SPA包被固定于檢測(cè)線(xiàn)7、6和質(zhì)控線(xiàn)8上。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述豬偽狂犬病病毒的檢測(cè)試紙的方法中，所述檢測(cè)線(xiàn)6、7與質(zhì)控線(xiàn)8任何兩條檢測(cè)線(xiàn)之間間隔距離≥3mm。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述豬偽狂犬病病毒的檢測(cè)試紙的方法中，所述檢測(cè)線(xiàn)6、7與質(zhì)控線(xiàn)8任何兩條檢測(cè)線(xiàn)之間間隔距離≥5mm。

本發(fā)明還涉及所述檢測(cè)試紙?jiān)跈z測(cè)豬偽狂犬病病毒gE蛋白抗體中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述檢測(cè)試紙?jiān)谂R床上能夠檢測(cè)感染了豬偽狂犬病野毒株后豬體所產(chǎn)生抗gE蛋白抗體，其靈敏度與商業(yè)上試劑盒靈敏度相當(dāng)。

本發(fā)明還涉及所述檢測(cè)試紙?jiān)跈z測(cè)豬偽狂犬病病毒gD蛋白抗體中的應(yīng)用。

本發(fā)明的豬偽狂犬病病毒的檢測(cè)試紙的gD蛋白對(duì)于檢測(cè)樣品中g(shù)D抗體水平的檢測(cè)結(jié)果與中和抗體效價(jià)、攻毒保護(hù)結(jié)果之間保持一致，能夠評(píng)價(jià)豬偽狂犬病活疫苗的免疫效果，同時(shí)可用于檢測(cè)豬偽狂犬病活疫苗質(zhì)量。

本發(fā)明的檢測(cè)試紙顯示檢測(cè)結(jié)果形象、直觀(guān)準(zhǔn)確。鑒別檢測(cè)試紙以顯示紅棕色“│”、“││”和“│││”印跡作為檢測(cè)的陰性、疫苗毒株感染和野毒株感染陽(yáng)性標(biāo)記，即在硝酸纖維素檢測(cè)區(qū)5上顯示一條棕紅色條帶“│”為實(shí)驗(yàn)成立，且豬偽狂犬病毒抗體陰性，表示被檢測(cè)樣品無(wú)疫苗毒株或強(qiáng)野毒株感染，同時(shí)提醒該養(yǎng)殖場(chǎng)需進(jìn)行豬偽狂犬病疫苗免疫；兩條棕紅色條帶“││”為豬偽狂犬病毒疫苗gD抗體陽(yáng)性，說(shuō)明為豬偽狂犬疫苗毒株感染，表示該養(yǎng)殖場(chǎng)豬偽狂犬病疫苗免疫有效，能夠有效預(yù)防豬偽狂犬病野毒株攻擊，近期不需要進(jìn)行疫苗免疫；三條棕紅色條帶“│││”為豬偽狂犬病毒gE抗體陽(yáng)性，表示被檢樣品為野毒株感染風(fēng)險(xiǎn)，若為種豬需進(jìn)行淘汰；若為商品豬需及時(shí)隔離和進(jìn)行豬偽狂犬病疫苗緊急免疫接種。

下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

本發(fā)明實(shí)施例中所用到的化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。本發(fā)明所述的實(shí)驗(yàn)方法，若無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所述的生物材料，若無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1 PRV gD蛋白的制備

1、病毒DNA的提取和PRV gD基因擴(kuò)增

在生長(zhǎng)良好的PK15細(xì)胞上接種PRV HN1201病毒(豬偽狂犬病病毒株為HN1201株(Pseudorabies virus，strain HN1201)，保藏號(hào)為CCTCCNO.V201311；保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址為中國(guó)武漢·武漢大學(xué)，保藏日期為2013年5月20日)，收獲病毒后用TAKARA公司MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒提取PRV基因組DNA。取1μl基因組DNA作為模板，利用gD特異性引物：

gDSF:5′GTGATGGTGATGGTGATGGTGATGATGCTGCTCGCAGCGCTATTGGC3′

gDSR:5′CTACGGACCGGGCTGCGCTTTTAG3′

進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用TAKARA的高保真酶HS DNA Polymerase withGC Buffer，擴(kuò)增條件為：94℃3min；94℃30s，68℃90s，30cycles；72℃5min。PCR產(chǎn)物命名為gD。其核苷酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.3，推導(dǎo)其氨基酸序列為SEQ.ID.NO.1。

2、重組Bacmid的獲取及鑒定

將高保真酶擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物gD克隆至pFastBac/HBM-TOPO載體(購(gòu)自Invitrogen公司，貨號(hào)A11339)，克隆體系如下：gD PCR產(chǎn)物4μl，Salt solution(鹽溶液)1μl，TOPO vector1μl，共6μl?；旌暇鶆颍覝胤跤?min，轉(zhuǎn)化One ShotR Mach1TMT1R感受態(tài)細(xì)胞，涂布氨芐青霉素抗性平板，挑取單克隆鑒定gD基因的插入方向，插入方向正確的質(zhì)粒送Invitrogen公司測(cè)序，鑒定gD序列的正確性。測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pFastBac/HBM-TOPO-gD。

pFastBac/HBM-TOPO-gD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自Invitrogen，貨號(hào)10361012)，pFastBac/HBM-TOPO-gD和感受態(tài)細(xì)胞中的穿梭質(zhì)粒Bacmid進(jìn)行轉(zhuǎn)座，用Invitrogen的PureLinkHiPure Plasmid DNA Miniprep Kit提取獲得的重組質(zhì)粒，并用pUCM13Forward/pUCM13Reverse引物鑒定gD的插入，陽(yáng)性Bacmid命名為Bacmid-gD。

3、轉(zhuǎn)染獲得重組桿狀病毒

按照Invitrogen公司Bac-to-Bac HBM TOPO Secreted Expression System的說(shuō)明書(shū)提供的方法進(jìn)行。6孔板每孔鋪8×10⁵個(gè)sf9細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后按照Cellfectin Ⅱ轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染：分別稀釋8μl Cellfectin Ⅱ和1μg Bacmid-gD DNA到100ulSF-900 Ⅱ培養(yǎng)基中，Vortex混勻，混合稀釋后的DNA與稀釋后的Cellfectin Ⅱ(總體積約210μl),混合均勻室溫孵育15～30min，滴加到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后72h待出現(xiàn)細(xì)胞病變后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，記為P0代重組病毒vBac-gD。P0代重組病毒vBac-gD感染sf9細(xì)胞，經(jīng)3代擴(kuò)大培養(yǎng)后，獲得的P3代vBac-gD用于重組蛋白表達(dá)。

4、重組桿狀病毒感染High-five細(xì)胞獲得重組蛋白

將P3代重組桿狀病毒vBac-gD接種High-five細(xì)胞(購(gòu)自Invitrogen，貨號(hào)B85502)。500ml三角瓶中懸浮培養(yǎng)High-five細(xì)胞，至細(xì)胞密度達(dá)到7.0×10⁵cell/ml后，按照1MOI的量接種病毒，感染后72h收取細(xì)胞培養(yǎng)上清。利用Millipore的切向流過(guò)濾系統(tǒng)將體積濃縮為原來(lái)體積的1/10。用1％(體積比)的Triton X-100(購(gòu)自sigma)滅活桿狀病毒，SDS-PAGE光密度法測(cè)定蛋白含量為200μg/ml，所制備PRV gD可用于檢測(cè)試紙疫苗毒株檢測(cè)線(xiàn)7印跡的印制。

實(shí)施例2PRV gE蛋白的制備

1、病毒DNA的提和PRV gE基因擴(kuò)增

病毒DNA提取參照PRV gD蛋白的制備中1。取1μl基因組DNA作為模板，利用gE特異性引物：

gESF5'-GTGATGGTGATGGTGATGGTGATGGAGGCCCCG

AGCCTCTCCGCCG-3'；和

gESR5'-CGCCAGCACAAACAGCCGCCCG-3'。

使用HS DNA Polymerase和設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)gE片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃2min；進(jìn)入PCR循環(huán)，98℃10s，60℃5s，72℃1min30s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物命名為gE。其核苷酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.4，推導(dǎo)其氨基酸序列為SEQ.ID.NO.2。

2、重組Bacmid的獲取及鑒定

將高保真酶擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物gE克隆至pFastBac/HBM-TOPO載體(購(gòu)自Invitrogen公司，貨號(hào)A11339)，克隆體系如下：gE PCR產(chǎn)物4μl，Salt solution(鹽溶液)1μl，TOPO vector1μl，共6μl?；旌暇鶆?，室溫孵育5min，轉(zhuǎn)化One ShotR Mach1TMT1R感受態(tài)細(xì)胞，涂布氨芐青霉素抗性平板，挑取單克隆鑒定gE基因的插入方向，插入方向正確的質(zhì)粒送Invitrogen公司測(cè)序，鑒定gE序列的正確性。測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pFastBac/HBM-TOPO-gE。

pFastBac/HBM-TOPO-gE質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自Invitrogen，貨號(hào)10361012)，pFastBac/HBM-TOPO-gE和感受態(tài)細(xì)胞中的穿梭質(zhì)粒Bacmid進(jìn)行轉(zhuǎn)座，用Invitrogen的PureLinkHiPure Plasmid DNA Miniprep Kit提取獲得的重組質(zhì)粒，并用pUCM13Forward/pUCM13Reverse引物鑒定gE的插入，陽(yáng)性Bacmid命名為Bacmid-gE。

3、轉(zhuǎn)染獲得重組桿狀病毒

按照Invitrogen公司Bac-to-Bac HBM TOPO Secreted Expression System的說(shuō)明書(shū)提供的方法進(jìn)行。6孔板每孔鋪8×10⁵個(gè)sf9細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后按照Cellfectin Ⅱ轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染：分別稀釋8μl Cellfectin Ⅱ和1μg Bacmid-gD DNA到100ulSF-900 Ⅱ培養(yǎng)基中，Vortex混勻，混合稀釋后的DNA與稀釋后的Cellfectin Ⅱ(總體積約210μl),混合均勻室溫孵育15～30min，一滴滴加到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后72h待出現(xiàn)細(xì)胞病變后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，記為P0代重組病毒vBac-gE。P0代重組病毒vBac-gE感染sf9細(xì)胞，經(jīng)3代擴(kuò)大培養(yǎng)后，獲得的P3代vBac-gE用于重組蛋白表達(dá)。

4、重組桿狀病毒感染High-five細(xì)胞獲得重組蛋白

將P3代重組桿狀病毒vBac-gE接種High-five細(xì)胞(購(gòu)自Invitrogen，貨號(hào)B85502)。500ml三角瓶中懸浮培養(yǎng)High-five細(xì)胞，至細(xì)胞密度達(dá)到7.0×10⁵cell/ml后，按照1MOI的量接種病毒，感染后72h收取細(xì)胞培養(yǎng)上清。采用Ni柱親和層析純化蛋白，用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)定蛋白含量為12mg/ml，所制備PRV gE蛋白可用于檢測(cè)試紙豬偽狂犬野毒株感染檢測(cè)線(xiàn)6印跡的印制。

實(shí)施例3兔抗豬IgG多克隆抗體制備

1、豬IgG制備

購(gòu)買(mǎi)SPF仔豬，無(wú)菌采血，分離血清，用辛酸-硫酸銨法純化IgG。取20ml血清，加生理鹽水20ml，再逐滴加入(NH₄)₂SO₄飽和溶液10ml，使成20％(NH₄)₂SO₄溶液，邊加邊攪拌，充分混合后，靜置30min；3000r/min離心20min，棄去沉淀，以除去纖維蛋白；在上清液中再加(NH₄)₂SO₄飽和溶液30ml，使成50％(NH₄)₂SO₄溶液，充分混合，靜置30min；3000r/min離心20min，棄上清；于沉淀中加20ml生理鹽水，使之溶解，再加(NH₄)₂SO₄飽和溶液10ml，使成33％(NH₄)₂SO₄溶液，充分混合后，靜置30min；3000r/min離心20min，棄上清，以除去白蛋白。重復(fù)步驟5，2～3次；用10ml生理鹽水溶解沉淀，裝入透析袋；透析除鹽，在常溫水中透析過(guò)夜，再在生理鹽水中于4℃透析24h，中間換液數(shù)次，以1％BaCl₂檢查透析液中的SO₄^2-或以納氏試劑檢查NH₄⁺(取3～4ml透析液，加試劑1～2滴，出現(xiàn)磚紅色即認(rèn)為有NH₄⁺存在)，直至無(wú)SO₄^2-或NH₄出現(xiàn)為止(也可采用Sephadex G25或電透析除鹽)；離心去沉淀(去除雜蛋白)，上清液即為粗提IgG；過(guò)DEAE-纖維素層析柱，以0.01mol/L pH7.4PBS(0.03mol/L NaCl)洗脫，收集洗脫液(也可采用SephadexG150或G200柱)；用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)定純化豬IgG的蛋白含量，達(dá)到5.1mg/ml以上。

2、兔抗豬IgG多克隆抗體

以純化的豬IgG與等量弗氏完全佐劑乳化后采用多點(diǎn)注射方式免疫SPF兔子，每隔兩周加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫2次，加強(qiáng)免疫時(shí)用純化的豬IgG與等量弗氏不全佐劑乳化。

以瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)測(cè)定免疫血清抗體效價(jià)高于1：64時(shí)，采集高免兔全血，分離血清，以辛酸-硫酸銨法純化兔抗豬IgG多克隆抗體方法參考3.1，測(cè)定IgG蛋白濃度6.2mg/ml)，所制備兔抗豬IgG多克隆抗體可用于膠體金標(biāo)記。

實(shí)施例4兔抗豬IgG多克隆抗體的膠體金標(biāo)記

1、將HAuC1₄先配制成0.01％水溶液，取100ml加熱至沸。

2、攪動(dòng)下準(zhǔn)確加入1.0ml的1％檸檬酸三鈉(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)水溶液。

3、繼續(xù)加熱煮沸15min。此時(shí)可觀(guān)察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色，全過(guò)程約2～3min。冷卻至室溫后用蒸餾水恢復(fù)至原體積100ml，置于4℃保存。

4、用0.2mol/LK₂CO₃調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH至8.2，勻速攪拌30min。

5、將1/10體積的1.0mg/ml兔抗豬IgG多克隆抗體溶液加于膠體金溶液中，勻速攪拌30min，逐滴加入適量的10％BSA，勻速攪拌30min。

6、置于4℃2小時(shí)后，4℃2000r/min離心30min，棄去沉淀，上清于10000r/min繼續(xù)離心30min，棄去上清，沉淀即為膠體金標(biāo)記的抗體，-20℃保存。

實(shí)施例5豬偽狂犬病病毒膠體金檢測(cè)試紙條的制備

1、硝酸纖維素檢測(cè)膜的制備

包被將PRV gE蛋白用PB工作液(1L雙蒸水溶解5.80g Na₂HPO₄·12H₂O和0.59gNaH₂PO₄·2H₂O)稀釋至1mg/ml，用噴膜儀包被于硝酸纖維素膜靠近金標(biāo)墊4處，作為豬偽狂犬野毒株檢測(cè)線(xiàn)6；PRV gD蛋白用PB工作液稀釋至0.55mg/ml，用噴膜儀包被于6檢測(cè)線(xiàn)下方，作為豬偽狂犬疫苗毒株檢測(cè)線(xiàn)7；金黃色葡萄球菌SPA用PB工作液稀釋至3.0mg/ml，用噴膜儀包被于7檢測(cè)線(xiàn)下方，作為質(zhì)控線(xiàn)8；膜的寬度為18mm，兩線(xiàn)間距為5mm，置干燥間干燥。

2、干燥與封裝

將包被好的硝酸纖維素膜置于干燥間(溫度為20～25℃，濕度低于20％)干燥3小時(shí)。將干燥的硝酸纖維素膜貼于塑料底板的中間，用自動(dòng)斬切機(jī)裁成合適大小(長(zhǎng)為60mm，寬為4mm)，干燥間密封保存。

3、金標(biāo)墊的制備

取稀釋好的金標(biāo)單兔抗豬IgG多克隆抗體，均勻加到玻璃纖維濾膜上，干燥間(溫度為20～25℃，濕度低于20％)干燥12～16小時(shí)。用自動(dòng)斬切機(jī)裁成合適大小(長(zhǎng)為70mm，寬為4mm)。常溫密封干燥保存。

4、樣品墊的制備

將玻璃纖維濾膜用自動(dòng)斬切機(jī)裁成合適大小(長(zhǎng)為15mm，寬為4mm)，常溫密封干燥保存。

5、吸水墊的制備

將吸水濾紙用自動(dòng)斬切機(jī)裁成合適大小(長(zhǎng)為25mm，寬為4mm)，常溫密封干燥保存。

6、試紙條的制備

本發(fā)明豬偽狂犬病病毒的檢測(cè)試紙?jiān)O(shè)置參見(jiàn)圖1、圖2進(jìn)行，圖中，1為支撐板用不吸水PVC底板，2為吸水墊，3為樣品墊，4為吸附膠體金標(biāo)記的兔抗豬IgG多克隆抗體的金標(biāo)墊，5為采用硝酸纖維素膜制備的檢測(cè)區(qū)，6為用特異識(shí)別豬偽狂犬病毒強(qiáng)毒株但不與疫苗毒株反應(yīng)的gE蛋白在硝酸纖維素膜上印制的豬偽狂犬強(qiáng)毒檢測(cè)線(xiàn)印跡“|”，7為特異識(shí)別豬偽狂犬病毒野毒株以及疫苗毒株反應(yīng)的gD蛋白在硝酸纖維素膜上印制的豬偽狂犬疫苗毒株檢測(cè)線(xiàn)印跡“|”，8為金黃色葡萄球菌SPA在硝酸纖維素膜上印制的質(zhì)控線(xiàn)印跡“|”，在硝酸纖維素檢測(cè)區(qū)5上的強(qiáng)毒檢測(cè)線(xiàn)印跡、疫苗毒株檢測(cè)線(xiàn)印跡和質(zhì)控線(xiàn)印跡組合排列為“|||”。以上組分之間交界處纖維互相交叉滲透。

本發(fā)明試紙的檢測(cè)原理為：將試紙條樣品墊3上滴加三蒸水，室溫下作用10～15min，只在質(zhì)控線(xiàn)8線(xiàn)出現(xiàn)一條紅線(xiàn)，檢測(cè)線(xiàn)6、7線(xiàn)不顯紅色，表明陰性結(jié)果成立。鑒別檢測(cè)豬血清時(shí)試紙以顯示紅棕色“│”、“││”和“│││”印跡作為檢測(cè)的陰性、疫苗毒株免疫和野毒株感染陽(yáng)性標(biāo)記，即在硝酸纖維素檢測(cè)區(qū)5上顯示一條棕紅色條帶“│”為試驗(yàn)成立，表明豬偽狂犬病毒抗體陰性，表示被檢測(cè)樣品無(wú)疫苗毒株或強(qiáng)野毒株感染，同時(shí)提醒該養(yǎng)殖場(chǎng)豬偽狂犬病毒抗體陰性，有爆發(fā)豬偽狂犬病風(fēng)險(xiǎn)，需進(jìn)行豬偽狂犬病疫苗免疫；兩條棕紅色條帶“││”為豬偽狂犬病毒疫苗gD抗體陽(yáng)性，表示該養(yǎng)殖場(chǎng)豬偽狂犬病疫苗免疫有效，能夠有效預(yù)防豬偽狂犬病野毒株攻擊；三條棕紅色條帶“│││”為豬偽狂犬病毒gE抗體陽(yáng)性，表示被檢樣品為野毒株感染風(fēng)險(xiǎn)，若為種豬需進(jìn)行淘汰；若為商品豬需及時(shí)隔離和進(jìn)行豬偽狂犬病疫苗緊急免疫接種。

實(shí)施例6豬偽狂犬病病毒膠體金檢測(cè)試紙條檢測(cè)結(jié)果與攻毒保護(hù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)

將21日齡PRV抗體陰性仔豬25頭隨機(jī)分成5組，5頭/組。第1組頸部肌肉免疫豬偽狂犬活疫苗，1ml(含10^6.0TCID₅₀)，第2組頸部肌肉免疫豬偽狂犬活疫苗，1ml(含10^5.0TCID₅₀)，第3組頸部肌肉免疫豬偽狂犬活疫苗，1ml(含10^4.0TCID₅₀)，第4組頸部肌肉免疫豬偽狂犬活疫苗，1ml(含10^3.0TCID₅₀)，第5組不免疫為對(duì)照組。免疫后28日采血，用豬偽狂犬病gB抗體檢測(cè)試劑盒和豬偽狂犬病病毒膠體金檢測(cè)試紙條檢測(cè)抗體，參照GB/T18641-2002方法血清中和試驗(yàn)的方法測(cè)定中和抗體。免疫28日后攻毒，攻毒劑量為豬偽狂犬病病毒HN1201株10^6.0TCID50/頭，試驗(yàn)結(jié)果：豬偽狂犬病gB抗體檢測(cè)試劑盒、豬偽狂犬病病毒膠體金檢測(cè)試紙條、中和抗體及攻毒保護(hù)之間關(guān)系見(jiàn)表1。

攻毒0日、5日、7日、11日、14日采血，用豬偽狂犬病病毒gE抗體檢測(cè)試劑盒和豬偽狂犬病病毒膠體金檢測(cè)試紙條檢測(cè)gE抗體。攻毒觀(guān)察至14日，統(tǒng)計(jì)各組疫苗保護(hù)情況。試驗(yàn)結(jié)果：豬偽狂犬病病毒gE抗體檢測(cè)試劑盒和豬偽狂犬病病毒膠體金檢測(cè)試紙條gE抗體結(jié)果比較見(jiàn)表2。

表1免疫期28天后抗體檢測(cè)結(jié)果及攻毒保護(hù)統(tǒng)計(jì)

結(jié)果顯示，豬偽狂犬病病毒膠體金檢測(cè)試紙檢測(cè)的陽(yáng)性率與攻毒保護(hù)結(jié)果一致性較高，有研究報(bào)道豬偽狂犬活疫苗中和抗體效價(jià)在1：10以上可對(duì)豬偽狂犬野毒株產(chǎn)生保護(hù)(Engel M,Wierup M.Eradication of ADV from a Swedish pig herd using gI^-/TK^-Vaccine[J].VetREC，1997,140(19)493～495.。豬偽狂犬病gB抗體檢測(cè)試劑盒、豬偽狂犬病病毒膠體金檢測(cè)試紙、中和抗體及攻毒保護(hù)之間存在一致性，研究結(jié)果顯示本發(fā)明的豬偽狂犬病病毒檢測(cè)試紙可以用來(lái)評(píng)價(jià)豬偽犬病活疫苗免疫效果評(píng)價(jià)以及豬偽犬病活疫苗質(zhì)量評(píng)價(jià)。

表2攻毒后gE抗體檢測(cè)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果顯示，鑒別豬偽狂犬病毒檢測(cè)試紙?jiān)诠ザ竞?日能檢測(cè)到野毒株，與豬偽狂犬病病毒gE抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果相近。從檢測(cè)結(jié)果分析豬偽狂犬病病毒檢測(cè)試紙能特異性區(qū)分豬只為疫苗毒株或者野毒株感染。

表1和表2表明，豬偽狂犬病病毒檢測(cè)試紙能快速、簡(jiǎn)便評(píng)價(jià)豬偽狂犬活疫苗免疫后的免疫效果及特異性區(qū)分豬只是否感染野毒株，可以用于養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)疫苗免疫后評(píng)價(jià)及種豬PRV凈化。

實(shí)施例7豬偽狂犬病病毒膠體金檢測(cè)試紙條應(yīng)用

某養(yǎng)殖場(chǎng)免疫豬偽狂犬活疫苗28天后采集血清，包括種公豬、種母豬和仔豬。

檢測(cè)結(jié)果及分析結(jié)果如表3：

表3檢測(cè)結(jié)果及分析

注：“│”代表gE、gD抗體陰性；“││”代表gE抗體陰性、gD抗體陽(yáng)性；“│││”代表gE、gD抗體陽(yáng)性。

將上述仔豬36#、38#、39#、40#、41#、42#、43#、44#進(jìn)行攻毒，攻毒劑量為豬偽狂犬病病毒HN1201株10^6.0TCID50/頭，攻毒后觀(guān)察臨床癥狀，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4仔豬攻毒結(jié)果

同時(shí)對(duì)上述仔豬37#和45#通過(guò)PCR進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示均為偽狂犬野毒株感染。

上述田間實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，在臨床上本發(fā)明的豬偽狂犬病病毒檢測(cè)試紙檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，能有效區(qū)分疫苗毒株與野毒株感染，準(zhǔn)確判定疫苗免疫保護(hù)效力，對(duì)于疫苗免疫后的效果評(píng)價(jià)及PRV凈化有著重要的作用。

以上全面描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但是可對(duì)它們進(jìn)行各種替代和修改。因此，不應(yīng)參照以上描述來(lái)決定本發(fā)明的范圍，而是應(yīng)參照所附權(quán)利要求書(shū)及其全部等同物來(lái)決定本發(fā)明的范圍。任何特征，(不論是否為優(yōu)選)均可與任何其他特征(不論是否為優(yōu)選)相結(jié)合。本發(fā)明的權(quán)利要求書(shū)不應(yīng)被理解為具有方法+功能的限制，除非在某一權(quán)利要求中通過(guò)術(shù)語(yǔ)“…的方法”明確地列舉出此類(lèi)限制。