本發(fā)明屬于生物分析領(lǐng)域，尤其是涉及一種煙葉中煙堿、降煙堿和亞硝基降煙堿濃度的UPLC-MS/MS檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：煙草中的生物堿主要以有機(jī)酸鹽和無機(jī)酸鹽的形式存在,主要有煙堿、降煙堿和新煙堿等。煙堿(又名尼古丁,nicotine)是煙草中生物堿的主要成分,在煙草中的含量一般為1％～2％,占煙草生物堿的95％,是導(dǎo)致人吸煙上癮的主要因子。其化學(xué)名稱為1-甲基-2-(2-吡啶基)吡咯烷[1～2]。煙堿也是煙氣中最主要的生物堿,是主流煙氣中具有毒性的粒相成分,中等劑量的煙堿能使人呼吸加快、血管舒張和嘔吐明顯加劇,稍高劑量的煙堿可引起震顫和痙攣。煙堿固然有害,但也有某些益處,如可使人得到安慰和快感,解除焦慮,調(diào)節(jié)情緒,平息激動(dòng)和煩燥,增強(qiáng)記憶和技巧,降低肥胖的食欲,在腦內(nèi)可模擬乙酰膽堿的作用,從而減輕帕金森綜合癥和老年性癡呆癥等。因此,煙堿是評(píng)價(jià)煙葉品質(zhì)的主要指標(biāo),也是衡量煙氣質(zhì)量的主要指標(biāo)。煙堿及其代謝物含量的高低不僅影響煙葉、煙制品和相關(guān)產(chǎn)品(如煙草香料、農(nóng)藥等)的質(zhì)量,還關(guān)系到人體健康。所以,很多研究者不僅對(duì)煙草、卷煙、總粒相物和農(nóng)藥中的煙堿進(jìn)行測(cè)定,而且還對(duì)唾液、頭發(fā)、血液、尿、空氣等中的煙堿及其代謝物的含量進(jìn)行分析,以探索煙堿對(duì)人體的影響。N-亞硝基降煙堿(NNN)，NNN是發(fā)現(xiàn)最早的一個(gè)煙草特有亞硝胺，并且在1977年報(bào)道了烤煙品Coker139中的NNN的平均含量為1.31mg/kg。煙草特有亞硝胺有致癌性，N-亞硝基降煙堿NNN致癌性最為強(qiáng)烈。所以對(duì)煙草中NNN的檢測(cè)尤為重要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)效率高、成本低的煙堿、降煙堿和亞硝基降煙濃度檢測(cè)方法，尤其適合對(duì)煙草中對(duì)煙堿、降煙堿和亞硝基降煙濃度的檢測(cè)。本發(fā)明的技術(shù)方案是：煙葉中煙堿、降煙堿和亞硝基降煙堿濃度的UPLC-MS/MS檢測(cè)方法：(1)樣品處理：稱取煙葉樣品粉末至10mL容量瓶中，加入甲醇3-5ml進(jìn)行提取，超聲，再用甲醇定容至刻度，搖勻后取上清液過膜，得煙葉樣品提取液。樣品不稀釋：取煙葉樣品提取液5μL進(jìn)樣UPLC-MS/MS分析，主要用于降煙堿和亞硝基降煙堿含量測(cè)定，此時(shí)由于煙堿成分含量高，測(cè)定時(shí)，在煙堿出峰時(shí)間段不進(jìn)行質(zhì)譜采集。樣品稀釋100倍：取煙葉樣品提取液0.1mL至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻后取5μL進(jìn)樣UPLC-MS/MS分析，主要用于煙堿含量測(cè)定。(2)HPLC-MS/MS分析：將處理后的樣品用三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀，在以下條件下進(jìn)行分析檢測(cè)條件為：三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀，液相條件：流動(dòng)相：A:水，用氨水調(diào)pH至11.0B:甲醇流速：0.3ml/min進(jìn)樣量：5μL柱溫：45℃色譜柱：WatersACQUITYBEHC18,1.7μm,2.1*50mmColumn表1.梯度洗脫程序Time/minA％B％09553.510904.010904.019556955表2.質(zhì)譜條件其他質(zhì)譜參數(shù)：毛細(xì)管電壓(kV):3.2kV；源溫度(℃):120；脫溶劑氣溫度(℃):350；脫溶劑氣流量(L/Hr):800；氣簾氣流量(L/Hr):50；駐留時(shí)間(s)：0.1s(3)根據(jù)樣品的峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程中，計(jì)算煙葉中煙堿、降煙堿和亞硝基降煙的濃度。為了取得更好的技術(shù)效果，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)所用標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：煙堿系列溶液配制：將煙堿標(biāo)準(zhǔn)品100mg，加入2mL甲醇配制成50mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液，用稀釋液(乙腈/水＝1/1，V/V)配制成濃度為0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品母液配制：取降煙堿和亞硝基降煙堿的母液，用稀釋液配制成100μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品母液，用稀釋液(甲醇/水＝1/1，V/V)配制成濃度為0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。步驟(1)中樣品的處理方法：稱取煙葉樣品粉末20mg至10mL容量瓶中，加入甲醇3-5ml，超聲30min，再用甲醇定容至刻度，搖勻后取上清液過膜，得煙葉樣品提取液。表3三化合物定量檢測(cè)線性與范圍本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：UPLC-MS/MS檢測(cè)方法檢測(cè)人尿中對(duì)羥基苯甲酸酯類濃度，簡(jiǎn)單快捷，靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)，適合多種食用防腐添加劑的同時(shí)定性定量檢測(cè)，為食品行業(yè)中食品中防腐添加劑的監(jiān)管提供了技術(shù)支持。附圖說明圖1是空白溶劑色譜圖，由上至下分別為亞硝基降煙堿，煙堿、降煙堿的色譜圖。圖2是2ng/ml的三化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖，由上至下分別為亞硝基降煙堿(RT＝1.71min)，煙堿(RT＝2.54min)、降煙堿(RT＝2.07min)的色譜圖。圖3是26號(hào)樣品(不采集煙堿質(zhì)譜信息)色譜圖，由上至下分別為亞硝基降煙堿(RT＝1.72min)，煙堿(RT＝2.54min)，降煙堿(RT＝2.07min)的色譜圖。圖4是26號(hào)樣品(稀釋100倍)色譜圖，由上至下分別為亞硝基降煙堿(RT＝1.72min)，煙堿(RT＝2.54min)、降煙堿(RT＝2.07min)的色譜圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1從市場(chǎng)購買7種樣煙葉作為檢測(cè)樣品，對(duì)其進(jìn)行編號(hào)分別為1號(hào)，2號(hào)，3號(hào)，26號(hào)，3-17號(hào)，A2-2號(hào)，W1號(hào)，按照
發(fā)明內(nèi)容中的方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，即：稱取煙葉樣品粉末20mg至10mL容量瓶中，加入甲醇3-5ml，超聲30min，再用甲醇定容至刻度，搖勻后取上清液過膜，得煙葉樣品提取液。樣品不稀釋：取煙葉樣品提取液5μL進(jìn)樣UPLC-MS/MS分析，用于降煙堿和亞硝基降煙堿含量測(cè)定，樣品稀釋100倍：取煙葉樣品提取液0.1mL至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻后取5μL進(jìn)樣UPLC-MS/MS分析，用于煙堿含量測(cè)定。在樣品進(jìn)樣分析前，標(biāo)準(zhǔn)曲線制備時(shí)需要先扣除空白溶劑的量，空白溶劑色譜圖見圖1。每種物質(zhì)扣除空白溶劑后得標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表3。然后將2ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品混合，進(jìn)樣分析，三種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣分析色譜圖見圖2。7種樣品進(jìn)樣分析后結(jié)果見表4。圖3為其中26號(hào)樣品的樣品不稀釋的色譜圖，此圖中，亞硝基降煙堿(RT＝1.72min)，降煙堿(RT＝2.07min)，圖4為26號(hào)樣品稀釋100倍的色譜圖，此圖中煙堿的RT＝2.54min。表4煙葉樣品中煙堿、降煙堿和亞硝基降煙堿含量測(cè)定結(jié)果ND表示為：未檢測(cè)到實(shí)施例22.1定量限檢測(cè)對(duì)煙堿、降煙堿及亞硝基降煙堿的定量限和檢測(cè)限是根據(jù)信噪比法來確定的。把已知濃度的貯備液稀釋至低濃度的試樣，測(cè)出的信號(hào)與空白處的信號(hào)(基線噪音)進(jìn)行比較，算出可能被可靠的檢測(cè)出的最低濃度或百分比。要求：定量限信噪比不低于10，測(cè)定6次峰保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0％，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于10.0％。定量限試驗(yàn)：取煙堿、降煙堿及亞硝基降煙堿適量，精密稱定，分別用乙腈/水＝1/1，V/V，甲醇/水＝1/1，V/V稀釋制成每1ml中含煙堿、降煙堿及亞硝基降煙堿0.5ng的溶液，精密量取該溶液10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，平行測(cè)定6次。結(jié)果表5。表5定量限試驗(yàn)結(jié)果結(jié)論定量限試驗(yàn)：重復(fù)測(cè)定6次，煙堿保留時(shí)間RSD為0.301％，峰面積的RSD為9.00％；降煙堿保留時(shí)間RSD為0.241％，峰面積的RSD為4.82％；亞硝基降煙堿保留時(shí)間RSD為0.336％，峰面積的RSD為4.74％；符合驗(yàn)證方案要求(峰保留時(shí)間RSD不得大于2.0％；峰面積RSD不得大于10.0％)；2.2系統(tǒng)精密度試驗(yàn)通過配制一個(gè)濃度的對(duì)照品溶液，對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6針，6次測(cè)定結(jié)果要具有良好的重復(fù)性；對(duì)照品溶液6次測(cè)定結(jié)果的峰面積的RSD不得過5.0％，保留時(shí)間的RSD不得過2.0％，來證實(shí)系統(tǒng)具有良好的精密度。具體操作：取線性系列溶液中100％的溶液，精密量取10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，重復(fù)進(jìn)樣6次。分別計(jì)算各峰面積和保留時(shí)間的RSD。測(cè)試結(jié)果表6對(duì)照品溶液精密度試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果結(jié)論煙堿對(duì)照品溶液重復(fù)6次的峰面積及保留時(shí)間的RSD分別為0.792％、0.186％；降煙堿對(duì)照品溶液重復(fù)6次的峰面積及保留時(shí)間的RSD分別為0.480％、0.227％；亞硝基降煙堿對(duì)照品溶液重復(fù)6次的峰面積及保留時(shí)間的RSD分別為0.434％、0.527％；說明系統(tǒng)精密度良好，符合方法學(xué)驗(yàn)證要求。2.3線性試驗(yàn)用稀釋液配制成濃度為0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500ng/mL的煙堿、降煙堿及亞硝基降煙堿系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行研究。線性關(guān)系以測(cè)得的響應(yīng)信號(hào)(峰面積)為縱坐標(biāo)(y)，以各被分析物濃度為橫坐標(biāo)(x)，進(jìn)行線性回歸分析。要求回歸方程的相關(guān)系數(shù)r的值不得小于0.990。具體操作稀釋液：乙腈/水＝1/1，V/V，甲醇/水＝1/1，V/V；煙堿系列溶液配制：將煙堿標(biāo)準(zhǔn)品100mg，加入2mL甲醇配制成50mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液，用稀釋液(乙腈/水＝1/1，V/V)配制成濃度為0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。注：配制煙堿標(biāo)準(zhǔn)曲線切記不可用甲醇/水＝1/1混合標(biāo)準(zhǔn)品母液配制：取降煙堿和亞硝基降煙堿的母液，用稀釋液配制成100μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品母液，用稀釋液(甲醇/水＝1/1，V/V)配制成濃度為0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。結(jié)果詳見表7、8。表7線性試驗(yàn)結(jié)果表8相關(guān)系數(shù)考察試驗(yàn)結(jié)果結(jié)論：煙堿、降煙堿及亞硝基降煙堿在0.5～500ng/ml的濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r≥0.9952。2.4回收試驗(yàn)準(zhǔn)確度是通過在供試品中加入指標(biāo)的70％，100％，130％三個(gè)不同濃度各雜質(zhì)對(duì)照品測(cè)得的回收率所得。加入已知量的分析物對(duì)照品，再測(cè)定加樣樣品中各化合物的測(cè)定結(jié)果和理論值之間的比值(回收率)，以百分率％表示，要求每個(gè)濃度平均回收率在80.0％～115.0％之間，RSD不高于10％，以證實(shí)方法具有良好的準(zhǔn)確度。具體操作煙堿系列溶液配制：將煙堿標(biāo)準(zhǔn)品100mg，加入2mL甲醇配制成50mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液，用稀釋液(乙腈/水＝1/1，V/V)配制成濃度為2000ng/mL的工作儲(chǔ)備溶液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品母液配制：取降煙堿和亞硝基降煙堿的母液，用稀釋液配制成100g/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品母液，用稀釋液(甲醇/水＝1/1，V/V)2000ng/mL的工作儲(chǔ)備溶液。稱取煙葉樣品粉末約20mg至10mL容量瓶中，加入甲醇，超聲30min，再用甲醇定容至刻度，搖勻后取上清液過膜，得煙葉樣品提取液(濃度未知)。精密量取煙堿及混合標(biāo)準(zhǔn)的工作儲(chǔ)備溶液各1ml，置于10ml量瓶，用甲醇稀釋至刻度，得到每1ml約含200ng的混合溶液，作為對(duì)照溶液。精密量取供試品儲(chǔ)備溶液1ml，置于10ml量瓶，用甲醇稀釋至刻度，作為樣品溶液。精密量取混合的工作儲(chǔ)備溶液1ml，置于10ml量瓶中，精密量取供試品儲(chǔ)備溶液1ml加入此量瓶，用甲醇稀釋至刻度，得到加標(biāo)100％的回收率樣品溶液。同法制備加標(biāo)70％和130％的回收率樣品溶液，其中加標(biāo)100％的樣品平行制備6份，同時(shí)考察重復(fù)性，其它兩個(gè)濃度水平平行制備三份樣品。分別取上述溶液10μl注入液相色譜儀，以測(cè)得量/添加量×100％計(jì)算回收率。測(cè)試結(jié)果結(jié)果詳見表9。表9回收率測(cè)試結(jié)果結(jié)論煙堿的回收率在94.2％～103％之間，RSD為3.26％；降煙堿的回收率在95.8％～104％之間，RSD為2.48％；煙堿的回收率在93.5％～102％之間，RSD為3.73％。符合驗(yàn)證方案要求，說明本方法準(zhǔn)確度高。2.5重復(fù)性試驗(yàn)重復(fù)性試驗(yàn)是通過配制6個(gè)100％加樣溶液，100％加樣溶液每個(gè)溶液進(jìn)樣1針，100％加樣溶液6次測(cè)得的測(cè)得量的RSD不得過5.0％，來證實(shí)方法具有良好的重復(fù)性。具體操作精密量取回收試驗(yàn)100％加樣溶液10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，照上述方法重復(fù)測(cè)定6次。結(jié)果表10。測(cè)試結(jié)果表10加樣溶液重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果結(jié)論加樣溶液6次煙堿測(cè)得量的RSD為4.08％、降煙堿測(cè)得量的RSD為4.22％、亞硝基降煙堿測(cè)得量的RSD為4.43％、，符合驗(yàn)證方案要求，說明本方法重復(fù)性好。2.6溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)考察100％加樣溶液隨時(shí)間的變化規(guī)律。100％加樣溶液室溫放置在0、0.5、2、4小時(shí)后考察雜質(zhì)峰面積的變化情況，要求：化合物的峰面積RSD應(yīng)不大于10.0％。若符合驗(yàn)證方案要求，則說明對(duì)照品溶液在該時(shí)間段內(nèi)放置是穩(wěn)定的，為以后檢測(cè)時(shí)測(cè)試溶液放置時(shí)間的期限提供依據(jù)。具體操作分別取煙堿、降煙堿、亞硝基降煙堿及樣品適量，精密稱定，用甲醇稀釋制成每1ml中分別含煙堿、降煙堿、亞硝基降煙堿20ng的溶液，作為100％加樣溶液。分別于0、0.5、2、4小時(shí)，精密量取100％加樣溶液10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果表11。試驗(yàn)結(jié)果結(jié)論本品100％加樣溶液在4h內(nèi)穩(wěn)定。以上對(duì)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，不能被認(rèn)為用于限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。凡依本發(fā)明申請(qǐng)范圍所作的均等變化與改進(jìn)等，均應(yīng)仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3