本發(fā)明屬于土壤可溶性物質(zhì)檢測的
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及土壤可溶性有機碳同位素的測定，具體涉及一種土壤可溶性有機碳同位素的方法。
背景技術(shù)：
：土壤可溶性有機碳，是指土壤中在室溫及天然pH條件下，能溶于水相的有機物組成的混合碳素。實驗操作上通常是指能通過0.45μm微孔濾膜的水溶性有機物。土壤可溶性有機碳的化學(xué)組成為具有不同結(jié)構(gòu)及分子量大小的有機物，如低分子量的游離氨基酸、碳水化合物、有機酸等和大分子量的酶、氨基糖、多酚和腐殖質(zhì)等，但主要部分是水溶性有機碳。土壤可溶性有機碳是土壤有機碳庫的重要組成部分，主要來源于植物的凋落物、土壤有機物的礦化過程及土壤微生物及植物根系的分泌物等，因此，土壤可溶性有機碳受植物和微生物活動影響強烈，在土壤中移動快、不穩(wěn)定、易氧化、易分解、易礦化，可以反映土壤中潛在活性養(yǎng)分含量和周轉(zhuǎn)速率以及土壤養(yǎng)分循環(huán)和供應(yīng)狀況，可以用來指示土壤肥力和土壤物理性質(zhì)的變化以及綜合評價各種管理措施對土壤質(zhì)量的影響。另外，作為環(huán)境中重要的天然配位體和吸著載體，其通過吸附、絡(luò)合、螯合、共沉淀等一系列反應(yīng)與土壤水中的微量重金屬和有機污染物發(fā)生各種作用，從而影響后者的遷移活性、最終歸宿和生態(tài)毒性。因此，有必要深入研究土壤水溶性有機碳的組成和起源、遷移及歸宿等動力學(xué)過程,這就有賴于對特定樣品中水溶性有機碳含量及其同位素值的準確測定。土壤水溶性有機碳的提取方法有物理提取法和化學(xué)提取法，前者是指離心法，通過高速離心獲得土壤溶液，需要大量的土壤樣品和專門的離心機，不適用于干土樣品；后者主要指多水土質(zhì)量比法，它是測定土壤水溶性有機碳含量的有效方法，該法的主要影響因素有提取溶劑的選擇、振蕩時間、提取溫度和土壤樣品的前處理等。含量測定，目前多采用總有機碳分析儀(TOC)直接測定，也有采用過硫酸鉀氧化法、重鉻酸鉀濕熱氧化法等，但一些復(fù)雜有機物會存在氧化不完全的情況，需要進行氧化系數(shù)校正。13C同位素示蹤法是研究有機碳的來源和動力學(xué)轉(zhuǎn)化的常用方法，用于可溶性有機碳的測定，目前已有許多技術(shù)，根據(jù)前處理產(chǎn)物形態(tài)不同，歸結(jié)為三類：第一類是前處理的產(chǎn)物是氣體，即對可溶性有機碳進行離線氧化，產(chǎn)生的CO2用雙路進樣的同位素比率質(zhì)譜儀(DI-IRMS)測定。采用超臨界氧化法和高溫封管燃燒干樣氧化法用于海水DOC中13C的測定。高溫封管燃燒干樣氧化法也被成功用于森林土壤提取液DOC中13C的測定。該類方法測定結(jié)果可靠，但前處理過程相當復(fù)雜、耗時，對實驗人員的技能要求較高，且石英管燃燒裝置價格昂貴，DI-IRMS也不是很普及。第二類是前處理的產(chǎn)物是固體，即采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、干燥，得到的固體用EA-CF-IRMS測定。該方法優(yōu)點是實驗操作過程可控性高，EA-CF-IRMS也較為普及，該類方法用于地下水、溪水、土壤溶液DOC中13C的測定，但EA-IRMS所需樣品量均在10ug-1mgC級，一些低含量的樣品難以滿足，無法用EA-IRMS進行測定，因此，現(xiàn)有技術(shù)普遍采用在EA和IRMS中間增加冷肼進行低溫聚焦，以及采用激光燒蝕進樣方式。第三類是前處理的產(chǎn)物為液體，即將TOC與IRMS聯(lián)用進行測定。此類方法前處理過程最為簡單，但擁有TOC-IRMS的實驗室卻很少。TOC的氧化方式有濕法氧化法(WO)和高溫催化燃燒法(HTC)，針對土壤溶液中的有機物(主要為富里酸和部分胡敏酸)，濕法氧化存在氧化困難和不完全的情況，該方法存在一定的弊端。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種測定土壤可溶性有機碳同位素的新方法。本發(fā)明為實現(xiàn)其目的采用的技術(shù)方案是：一種測定土壤可溶性有機碳同位素的方法，采用EA-IRMS法進行測定，先通過多水土質(zhì)量比法提取土壤水溶性有機碳，得到含土壤水溶性有機碳的溶液，然后將所得的溶液通過冷凍干燥進行濃縮，將濃縮后的物質(zhì)加純化水復(fù)溶、干燥后通過EA-IRMS進行δ13C值測定。多水土質(zhì)量比法提取土壤水溶性有機碳包括以下步驟：取0＜水土質(zhì)量比≤1的土壤樣品，加入到純化水，室溫下至少震蕩10min，離心，取上清液，調(diào)節(jié)pH值小于2，后經(jīng)0.45μm水系濾膜過濾，收集清液，得含土壤水溶性有機碳的溶液。用85％磷酸調(diào)節(jié)上清液的pH值小于2。采用85％磷酸即市售的濃磷酸，磷酸為非氧化性、非腐蝕性酸，且不易揮發(fā)，用85％磷酸除掉無機碳的同時，不會對有機碳造成破壞，實驗操作也更安全。若pH大于2，無機碳部分去除不完全，會影響DOC的δ13C值。濃縮包括以下步驟：A、冷凍處理：將含土壤水溶性有機碳的溶液于-20±1℃條件下冷凍24h；B、濃縮：將凍干機預(yù)冷30min至-52℃，將步驟A冷凍后的溶液置于凍干機中，控制凍干機的真空度為20±2Pa，冷凍干燥時間為48-50h，得到濃縮后的物質(zhì)。濃縮后的物質(zhì)加純化水復(fù)溶后得到復(fù)溶液，取復(fù)溶液于銀舟中，置于50±2℃烘箱中進行烘干干燥。所述的將濃縮后的物質(zhì)通過EA-IRMS進行測定具體為：將濃縮后的物質(zhì)經(jīng)EA燃燒，產(chǎn)生的CO2經(jīng)He攜帶進入IRMS進行同位素比值測定。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明通過聯(lián)合使用冷凍干燥、復(fù)溶和多次烘干的濃縮干燥方式，提高了操作可控性，保證了低含量樣品的測定。本發(fā)明創(chuàng)造性的將冷凍干燥的濃縮方式用于土壤溶液及浸提液中13C測定前處理，與旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)相比有較大優(yōu)點，不僅可以批量處理樣品，還可以避開高溫，避免揮發(fā)性有機物和熱不穩(wěn)定性有機物的損失。另外，土壤水溶性有機碳組成主要為糖類、氨基酸等非腐殖物質(zhì)和富里酸、富里酸一、二價鹽、胡敏酸一價鹽等腐殖物質(zhì)，各組分理化性質(zhì)和存在形態(tài)有著較大差異，冷凍干燥后的固形物中碎屑狀物和油狀物共存，直接取樣測定易造成取樣歧視，復(fù)溶后再取樣，可以實現(xiàn)樣品的均一化。本發(fā)明方法可用于土壤、沉積物、水體中可溶性有機碳同位素的測定，測量穩(wěn)定性好、精度高，通過EA-IRMS簡化了繁瑣的前處理手續(xù)，大大降低了人為造成的實驗誤差，具有高效、快速、便捷的優(yōu)點。本方法的優(yōu)勢，相較于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的濃縮方式，由于是純化水做浸提劑，即使是在負壓下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)實現(xiàn)濃縮也需要耗費大量的時間，且一臺旋蒸儀一次只能處理一個樣品，遇到大批量的樣品，幾乎是一個不可能實現(xiàn)的方法。另外，即使在負壓下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的水浴溫度也較高，不可避免地會造成一些揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定性有機物的損失。但本方法中的冷凍干燥就不同了，可以大批量地處理樣品，同時又避免了高溫，不會造成有機物的損失。具體實施方式本方法可用于土壤、沉積物中可溶性有機碳同位素的測定；也可用于有機質(zhì)含量較高的水體中可溶性有機碳同位素的測定，當用于有機質(zhì)含量較高的水體測定時，沒有浸提的環(huán)節(jié)，測定流程從酸化開始。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。1.水土質(zhì)量比的選擇水土質(zhì)量比法提取土壤水溶性有機碳，浸提劑水的用量必須大于土壤的飽和含水量。本方法中，選用了兩種質(zhì)地不同的土壤進行實驗。土壤的物理性質(zhì)如表1所示。表1被試土壤的物理性質(zhì)編號飽和含水量％粘粒％粉粒％砂粒％質(zhì)地類型146.041.6666.1732.17粉(砂)壤土255.90443818粘壤土設(shè)定不同的水土質(zhì)量比1:1，1:1.5，1:2，1:3，1:4，1:5，由土壤飽和含水量可知，不同水土質(zhì)量比，對應(yīng)的浸提劑用水量約為土壤飽和含水量的2，3，4，6，8，10倍。在25℃下，振蕩30min浸提土壤可溶性碳。振蕩頻率180r/min±20r/min。表2水土質(zhì)量比的選擇由結(jié)果可知，δ13C不隨水土質(zhì)量比的變化而變化，同時，考慮浸提液量少將可以縮短冷凍干燥的時間，故優(yōu)選的水土質(zhì)量比為1:1。2.振蕩時間的選擇浸提是一個動態(tài)平衡的過程，振蕩時間的長短，將直接影響提取到的可溶性碳的總量的多少，但對其中各種碳成分的比例(各組分對δ值的貢獻)沒有影響。在振蕩時間的選擇中，選用水土質(zhì)量比1:1，在25℃下，分別振蕩10min，20min，30min，1h，2h，5h提取土壤可溶性碳。表3振蕩時間的選擇振蕩時間10min20min30min1h2h5hSDδ13C(1)‰-19.67-19.35-19.66-19.84-19.83-19.830.19δ13C(2)‰-19.03-18.72-18.86-19.01-19.20-19.500.27由結(jié)果可知，振蕩時間10min及以上，δ13C不隨振蕩時間的延長而變化，表明，振蕩時間10min以上，浸提液中各種碳成分的比例基本一致。因此，優(yōu)選的振蕩時間為10min。3.冷凍干燥具體步驟收集經(jīng)0.45μm濾膜過濾的清液于50mL玻璃小瓶中，加蓋，于-20℃冷凍12h以上(例如24h)。凍干機預(yù)冷至-52℃，放入樣品，開啟真空泵，(真空降至約20Pa)，冷凍干燥開始，待樣品全部干燥完全，冷凍干燥結(jié)束。4.烘干溫度的選擇取復(fù)溶液于銀舟中，置于50±2℃烘箱中烘干，該溫度條件下烘干在避免破壞或者損失有機物的前提下，可以獲得較快的干燥速率。5.pH小于2用磷酸調(diào)節(jié)浸提上清液的pH小于2的目的在于完全去除無機碳，若無機碳去除不完全，將影響有機碳同位素值的準確測定。相較于現(xiàn)有技術(shù)中加入其它酸，如濃硫酸，濃硫酸是具有腐蝕性、氧化性的酸，對清液中的有機物造成局部破壞，而本方法中采用的磷酸為非揮發(fā)、非氧化性、非腐蝕性的酸，在酸化的過程中更利于有機物的保護，不會對有機物造成破壞。6.浸提劑用高純水本方法測定的是土壤可溶性有機碳，而非鹽溶性有機碳，應(yīng)當采用高純水，不能是去離子水，高純水中的離子含量微乎其微，離子干擾更少，更有利于離子化合物形態(tài)的可溶性有機物的提取，高純水的選擇是長期科學(xué)研究和生產(chǎn)實踐的總結(jié)。由于本方法測定的是土壤可溶性有機碳，而非鹽溶性有機碳，經(jīng)過長期的創(chuàng)造性研究總結(jié)到浸提劑應(yīng)當用高純水，不能用鹽水，否則會稀釋目標組分，影響最終的測量結(jié)果，例如0.5M的K2SO4做浸提劑的，若浸提得到的溶液為20ml，則冷凍干燥后得到物質(zhì)中將含有0.5mol/L*0.020L*174g/mol＝1.74g的K2SO4固體，大大稀釋了目標組分，且這么大的樣品量是沒法進樣的。7.EA-IRMS1)儀器條件EA-IRMS型號：EA(variopyrocube,Elementar,Germany)，IRMS(Isoprime100,Elementar,Germany)。IRMS真空度為IPHighVac.小于5e-7mBar(N2)，IPLowVac.小于3e-2mBar(N2)；加速電壓3863V；EA氧化柱填料為氧化銅、鉻酸鉛和氧化鋁球，氧化柱工作溫度為950℃，還原柱工作溫度為600℃，分離類型為吸附-解吸附；參考氣高純度CO2的標定：以用EA-IRMS的方式連續(xù)測定有證標準物質(zhì)20次，stdev小于0.15‰，然后計算得參考氣高純CO2的δ13C為-31.88‰；參考氣穩(wěn)定性為連續(xù)6次參考氣穩(wěn)定性結(jié)果stdDevoffit均小于0.06‰；參考氣線性為主同位素信號在1-15nA范圍內(nèi)，linearity小于0.06‰/nA。2)儀器樣品測試的準確性、靈敏度、精度、穩(wěn)定性以有證標準物質(zhì)小麥粉(WheatflourstandardOAS,CatNo.B2157-Batchno.114858,ElementalMicroanalysisLtd,UK)的測定值來判斷儀器條件，標準值δ13CV-PDB為-27.21‰±0.13‰。有證標準物質(zhì)小麥粉連續(xù)20次測定值如下，可見，測定值的準確度和精度完全符合要求。表4儀器樣品測試的準確度、精度和穩(wěn)定性次數(shù)δ13C‰次數(shù)δ13C‰1-27.2211-27.222-27.2512-27.203-27.2613-27.064-27.2114-27.065-27.1515-27.056-27.2116-27.167-27.1817-27.198-27.2618-27.259-27.1819-27.3910-27.2420-27.45average-27.21stdev0.10儀器靈敏度以產(chǎn)生1nA信號的碳量來計，以標準小麥粉的含碳量計算可知，1nA信號對應(yīng)的含碳量為65μg。儀器長時穩(wěn)定性以2h為間隔的有證標準物質(zhì)小麥粉的測定結(jié)果來表示，可見穩(wěn)定性良好。表5儀器樣品測試的24h穩(wěn)定性時間間隔hδ13C‰0-27.222-27.204-27.206-27.168-27.2510-27.2012-27.2614-27.2516-27.2518-27.2320-27.0322-27.2924-27.27stdev0.07實施例11)土樣水溶性有機碳的提?。悍Q取經(jīng)自然風干、過1mm篩的土壤樣品30g于250ml塑料瓶中，加入30ml高純水，即水土質(zhì)量比1:1，25℃下，振蕩10min，離心，取上清液；用85％磷酸酸化清液至pH小于2，后經(jīng)0.45μm水系濾膜過濾，收集清液于50ml玻璃小瓶中。2)樣品濃縮：將1)中清液冷凍干燥；向凍干后的樣品中，加入500μl高純水，渦旋震蕩使其復(fù)溶；取100μl復(fù)溶液于銀舟中，置于50℃烘箱中烘干，此過程重復(fù)2-5次，以累積樣品量至滿足儀器檢測需要，包好樣品。3)EA-IRMS測定：樣品經(jīng)EA在富氧燃燒管中燃燒，產(chǎn)生的CO2經(jīng)He攜帶進入IRMS。用經(jīng)有證標準物質(zhì)小麥粉(WheatflourstandardOAS,CatNo.B2157-Batchno.114858,ElementalMicroanalysisLtd,UK)對CO2參考氣進行δ值進行校正，對樣品測試結(jié)果進行計算。4)樣品平行測定6次。表6土壤樣品分析123456SDδ13C(1)‰-19.62-19.73-19.68-19.62-19.74-19.560.07δ13C(2)‰-18.87-19.01-18.91-19.09-19.02-19.150.10由表6可知，土壤樣品分析6次平行測定的SD小于0.1，表明該方法重現(xiàn)性好，樣品測試精密度高。滿足測定δ13C的分析要求的樣品含碳量：以有證標準物質(zhì)小麥粉的含碳量計算可知，1nA信號對應(yīng)的含碳量為65μg，即樣品含碳量65μg以上即可滿足儀器分析要求。當前第1頁1 2 3