本發(fā)明涉及一種蜂蠟藥物的檢測(cè)方法，特別涉及一種蜂蠟GC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的構(gòu)建方法，以及由此法得到的蜂蠟GC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

背景技術(shù)：

中藥指紋圖譜是指中藥原料藥材、飲片、成品、半成品等經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標(biāo)示其特征共有峰的圖譜。中藥指紋圖譜能客觀地揭示和反映中藥內(nèi)在質(zhì)量的整體性和特征性,用以評(píng)價(jià)中藥的真實(shí)性、有效性、穩(wěn)定性和一致性。中藥的臨床療效并非由單一活性成分的作用或多種活性成分作用的簡(jiǎn)單相加,用已知某一個(gè)或幾個(gè)活性成分或有效成分為質(zhì)量指標(biāo),通過(guò)定性和定量分析來(lái)判斷藥品質(zhì)量的優(yōu)劣,顯然是不全面的。中藥質(zhì)量的評(píng)價(jià)需要綜合的、宏觀的、非線性的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系,中藥指紋圖譜就是能較好地適應(yīng)這一特點(diǎn)的一種質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制模式。天然藥和草藥,都把指紋圖譜作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容之一。歐共體對(duì)草藥質(zhì)量的指南中也稱(chēng),單靠測(cè)定某有效成分考察質(zhì)量的穩(wěn)定性是不夠的,因?yàn)椴菟幖捌渲苿┦且哉w為活性物質(zhì)。世界衛(wèi)生組織(WHO)在1996年草藥評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則中規(guī)定:如果草藥的活性成分不明,可以提供特征色譜圖譜,以證明產(chǎn)品質(zhì)量的一致。因此指紋圖譜是中藥現(xiàn)代化和國(guó)際化的關(guān)鍵技術(shù)之一。

蜂蠟為蜜蜂科昆蟲(chóng)中華蜂蜜或意大利蜂分泌的蠟質(zhì)。其主要成分有酯類(lèi)、游離的烷醇類(lèi)、烷酸類(lèi)、維生素、芳香類(lèi)物質(zhì)等。蜂蠟具有多種藥理作用，比如降血脂、抑菌、治療胃潰瘍等藥理作用，因此蜂蠟在醫(yī)藥行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用。

2010版《中國(guó)藥典》僅有性狀鑒別的描述，理化鑒別、檢查項(xiàng)、含量測(cè)定等項(xiàng)均為空白，上述標(biāo)準(zhǔn)不能有效的監(jiān)控蜂蠟的質(zhì)量?jī)?yōu)劣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明建立了一種合理、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)蜂蠟整體性質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以及該指紋圖譜的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的目的在于提供一種原料藥蜂蠟GC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供原料藥蜂蠟GC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種原料藥蜂蠟GC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

1)從全國(guó)各不同地區(qū)收集不同批次的蜂蠟10批，進(jìn)行編號(hào)。

2)對(duì)蜂蠟進(jìn)行預(yù)處理，清理其中的雜質(zhì)。方法是水浴加熱至80℃然后冷凝，取上層固體蜂蠟使用。

3)制備蜂蠟供試品溶液：精密稱(chēng)取蜂蠟50mg置于50ml容量瓶中，加入三氯甲烷，超聲使其完全溶解，定容，使得蜂蠟溶液的濃度為1mg/ml左右。

4)空白溶液的制備：取少量三氯甲烷溶液置于氣相色譜進(jìn)樣瓶中，作為空白溶液和色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的對(duì)照。

5)蜂蠟的GC指紋圖譜的建立：分別取供試品溶液和空白溶液，進(jìn)樣，用安捷倫氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，色譜柱HP-5用(5％-苯基)-甲基聚硅氧烷為填充劑，氮?dú)鉃檩d氣流速為5mL/min，檢測(cè)器為氫火焰檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度為310℃，進(jìn)樣口溫度為330℃，分流比為20：1，氫氣流速為40mL/min，空氣流速為30mL/min，進(jìn)樣量為1μL，柱箱升溫方式為280℃維持15min。記錄供試品的保留時(shí)間和峰面積，即得蜂蠟的GC指紋圖譜。

本發(fā)明的步驟1)所述的收集蜂蠟的不同產(chǎn)地，從1-10進(jìn)行編號(hào)。

以上本發(fā)明的該指紋圖譜中有11個(gè)共有特征峰，從左到右編號(hào)為1-11，記錄11個(gè)共有峰的保留時(shí)間，編號(hào)為1至11號(hào)的特征峰的保留時(shí)間依次分別為2.105-2.117min，2.490-2.514min，2.759-2.790min，3.102-3.112min，3.512-3.564min，4.028-4.091min，4.664-4.742min，5.304-5.396min，5.441-5.536min，6.387-6.483min，7.279-7.414min。

氣相色譜儀測(cè)定至少10批蜂蠟供試品溶液的指紋圖譜，并進(jìn)行分析比較，并采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版進(jìn)行相似度分析，相似度評(píng)價(jià)見(jiàn)下表1，各批次供試品相似度與第一批相比均大于0.8。

表1

本發(fā)明的有益效果是：

1)本發(fā)明建立了原料藥蜂蠟GC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，代表著蜂蠟中的部分化學(xué)成分，能有效的表征蜂蠟原料藥的質(zhì)量，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)蜂蠟中含量較多的化學(xué)成分的檢測(cè)，有利于其質(zhì)量的全面監(jiān)控。

2)本發(fā)明建立原料藥蜂蠟GC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜作為一個(gè)整體，注重各個(gè)構(gòu)成指紋特征峰的前后順序，注重整體面貌特征，避免了因只測(cè)定一、二個(gè)化學(xué)成分而判定蜂蠟整體質(zhì)量的片面性。本發(fā)明為更全面、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)蜂蠟的質(zhì)量提供了新的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，能更好保證蜂蠟的質(zhì)量及其臨床療效。

3)本發(fā)明具有方法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、精密度高的特點(diǎn)，使用于蜂蠟原料藥的整體質(zhì)量控制。

4)本發(fā)明建立的指紋圖譜中共有峰分離度良好，特征明顯，具有較好的專(zhuān)屬性。

附圖說(shuō)明

圖1是蜂蠟的GC參照指紋圖譜；

圖2是1-8號(hào)產(chǎn)地蜂蠟相似度結(jié)果評(píng)價(jià)示意圖；

圖3是9-10號(hào)產(chǎn)地蜂蠟相似度結(jié)果評(píng)價(jià)示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)果實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳述，但并不局限于此。

實(shí)施例1：

由1-10批蜂蠟的產(chǎn)地分別為蘭州、鄭州、慶陽(yáng)、威海、成都、煙臺(tái)、哈爾濱、大連、廣元、濟(jì)南10個(gè)地方。

1.儀器與試劑

儀器：島津GC-2014C氣相色譜儀，日本島津公司；BS224S電子分析天平，感量0.0001g，德國(guó)Sartorius公司；中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版，國(guó)家藥典委員會(huì)。

試劑：三氯甲烷，分析純，500mL/瓶，批號(hào)：20131201，廣州化學(xué)試劑廠。

2.氣相測(cè)定的色譜條件：

色譜柱為HP-5，規(guī)格為30m*0.25mm*0.1um(安捷倫公司產(chǎn)品)，色譜柱填料為(5％-苯基)-甲基聚硅氧烷，檢測(cè)器為氫火焰檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度為310℃，進(jìn)樣口溫度為330℃，載氣為N₂，載氣流速為5mL/min，氫氣流速為40ml/min，空氣流速為30ml/min，進(jìn)樣量:1μL(設(shè)置進(jìn)樣前清洗進(jìn)樣針5次和進(jìn)樣后清洗進(jìn)樣針10次)，分流比為20：1，柱箱升溫方式：280℃維持15min。

3.蜂蠟GC指紋圖譜的建立：

1)供試品溶液制備

分別精密稱(chēng)取蜂蠟50mg置于50ml容量瓶中，加入三氯甲烷，超聲使其完全溶解，定容，使得蜂蠟溶液的濃度為1mg/ml左右。

2)蜂蠟指紋圖譜的建立

分別精密吸取適量供試品溶液置于進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行氣相測(cè)定，得到色譜圖。比較供試品的指紋圖譜，挑選11個(gè)特征共有峰，記錄共有峰的保留時(shí)間和峰面積，如圖二、三所示。

3)穩(wěn)定性檢測(cè)

為進(jìn)一步確定該檢測(cè)方法有效，取同一批蜂蠟供試品溶液，分別在0h、4h、8h、12h、16h、20h幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣，記錄11個(gè)共有峰的保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算其RSD，如圖一所示。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果11個(gè)共有峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于1％，供試品穩(wěn)定性良好。

4)重復(fù)性檢測(cè)。

取同批次蜂蠟的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，檢測(cè)所得指紋圖譜，考察11個(gè)共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的一致性，由RSD大小進(jìn)行判定。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蜂蠟11個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及峰面積的RSD均在1％以?xún)?nèi)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性符合要求。

為本領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員容易理解,以上所述僅為本發(fā)明專(zhuān)利的較佳實(shí)施例,并不用以限制本發(fā)明,凡本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改。等同替換和改進(jìn)等,均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。