本發(fā)明涉及到一種西洋參中人參皂苷類成分的含量測(cè)定方法,屬中藥技術(shù)領(lǐng)域,具體的,涉及一種西洋參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、擬人參皂苷F11、人參皂苷Rb1四種成分同時(shí)測(cè)定的含量測(cè)定方法。
背景技術(shù):
西洋參(學(xué)名:Panax quinquefolius)是五加科人參屬多年生草木植物,別名花旗參、洋參、西洋人參、American ginseng,原產(chǎn)于加拿大的大魁北克與美國(guó)的威斯康辛州,中國(guó)北京懷柔與長(zhǎng)白山等地也有種植。西洋參性涼,味甘、微苦;可補(bǔ)氣養(yǎng)陰,清熱生津。用于氣虛陰虧,內(nèi)熱,咳喘痰血,虛熱煩倦,消渴,口燥喉干。西洋參益肺陰,清虛火,生津止渴。治肺虛久嗽,失血,咽干口渴,虛熱煩倦。西洋參中主要成分為人參皂苷類,西洋參所含有效成分與人參單體皂苷類別基本相同,甚至所含皂苷元也完全一致,均系齊墩果酸、人參二醇和人參三醇。但由于人參二醇單體皂苷的Rb1的含量高于人參,因此,形成二者療效和應(yīng)用上的差異,各有特色不可互相替代。建立西洋參皂苷類成分的含量標(biāo)準(zhǔn),有利于指導(dǎo)臨床合理用藥,目前尚沒有西洋參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、擬人參皂苷F11、人參皂苷Rb1四種成分同時(shí)測(cè)定的含量測(cè)定方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于提供了一種西洋參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、擬人參皂苷F11、人參皂苷Rb1四種成分同時(shí)測(cè)定的含量測(cè)定方 法。
本發(fā)明含量測(cè)定方法采用超高效液相色譜法,該方法如下:
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈為流動(dòng)相A,以0.01%甲酸為流動(dòng)相B,進(jìn)行梯度洗脫,洗脫梯度為:0-6分鐘,流動(dòng)相A由18%漸變至21%;6-10分鐘,流動(dòng)相A由21%漸變至30%;10-18分鐘,流動(dòng)相A為30%漸變至35%;18-20分鐘,流動(dòng)相A為35%漸變至55%;蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,氣壓40psi,增益100,漂移管溫度60℃,流速0.4ml/min;柱溫為40℃;
對(duì)照品溶液的制備
取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Re對(duì)照品、擬人參皂苷F11和人參皂苷Rb1適量,精密稱定,加80%甲醇分別制成每1ml含人參皂苷Rg1為20μg、人參皂苷Re為800μg、擬人參皂苷F11為40μg、人參皂苷Rb1為900μg的混合溶液,即得;
供試品溶液的制備取西洋參,粉碎,過4號(hào)篩,取1.0g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入80%甲醇25ml,密塞,搖勻,稱定重量,加熱回流30-60min,放冷,再稱定重量,用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,即得;
測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各1-2μl,注入液相色譜儀,測(cè)定,以外標(biāo)法計(jì)算含量,即得。
本發(fā)明含量測(cè)定方法中,供試品溶液制備中水浴回流提取時(shí)間優(yōu)選為45min;測(cè)定法中分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液的量?jī)?yōu)選為2μl,注入液相色譜儀。
本發(fā)明含量測(cè)定方法最優(yōu)的技術(shù)方案為:
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈為流動(dòng)相A,以0.01%甲酸為流動(dòng)相B,進(jìn)行梯度洗脫,洗脫梯度為:0-6分鐘,流動(dòng)相A由18%漸變至21%;6-10分鐘,流動(dòng)相A由21%漸變至30%;10-18分鐘,流動(dòng)相A為30%漸變至35%;18-20分鐘,流動(dòng)相A為35%漸變至55%;蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,氣壓40psi,增益100,漂移管溫度60℃,流速0.4ml/min;柱溫為40℃;
對(duì)照品溶液的制備
取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Re對(duì)照品、擬人參皂苷F11和人參皂苷Rb1適量,精密稱定,加80%甲醇分別制成每1ml含人參皂苷Rg1為20μg、人參皂苷Re為800μg、擬人參皂苷F11為40μg、人參皂苷Rb1為900μg的混合溶液,即得;
供試品溶液的制備取西洋參,粉碎,過4號(hào)篩,取1.0g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入80%甲醇25ml,密塞,搖勻,稱定重量,加熱回流30-60min,放冷,再稱定重量,用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,即得;
測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各2μl,注入液相色譜儀,測(cè)定,以外標(biāo)法計(jì)算含量,即得。
為了驗(yàn)證測(cè)定含量方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、專屬性及系統(tǒng)適應(yīng)性,對(duì)方法進(jìn)行了以下方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),以確保該含量測(cè)定方法可以用于西洋參的質(zhì)量控制。
1儀器與試藥
1.1儀器
超高效液相色譜儀:Acquity,美國(guó)沃特世(WATERS);色譜柱:Acquity BEH C18(1.7μm,2.1mm×100mm);電子天平:Mettler AE163;Mettler AE240;超純水儀:Integral 10(MILLIPORE)。
1.2試藥與試劑
對(duì)照品:人參皂苷Rg1(中檢院提供,批號(hào)110703-201529,含量以95.0%計(jì))、人參皂苷Re(中檢院提供,批號(hào)110754-201525,含量以92.3%計(jì))、人參皂苷Rb1(中檢院提供,批號(hào)110704-201424,含量以93.7%計(jì))及擬人參皂苷F11(中檢院提供,批號(hào)110841-201406)。
試劑:乙腈為色譜純;水為超純水;其他試劑均為分析純。
2方法確定
2.1色譜條件
2.1.1測(cè)定方式的選擇
人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的測(cè)定波長(zhǎng)通常采用紫外203nm,但是因擬人參皂苷F11無紫外吸收,故采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。皂苷類成分極性大,用高效液相色譜儀耗時(shí)長(zhǎng),故采用UPLC在20分鐘內(nèi)完成測(cè)定。
2.1.2流動(dòng)相的選擇
流動(dòng)相選用乙腈-0.01%甲酸系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫,主要目標(biāo)是將人參皂苷Rg1、人參皂苷Re分離良好,擬人參皂苷F11及人參皂苷Rb1與雜質(zhì)分離良好。經(jīng)系統(tǒng)考察最終選定正文色譜條件,得到色譜圖基線平穩(wěn),成分峰形對(duì)稱、分離良好,見圖1,依次為人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Re對(duì)照品、擬人參皂苷F11和人參皂苷Rb1。
色譜條件:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈為流動(dòng)相A,以0.01%甲酸為流動(dòng)相B,按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫;柱溫為40℃。
2.2供試品溶液的制備
2.2.1提取方式的考察
取同一批樣品適量,分別超聲處理(功率400W,頻率40kHz)45分鐘、加熱回流45分鐘,按正文方法測(cè)定。結(jié)果表明加熱回流比超聲處理提取率略高。(結(jié)果見表1)。
表1 不同提取方式的含量測(cè)定結(jié)果
2.2.2提取時(shí)間的考察
取同一批樣品適量,分別加熱回流30、45、60min,按正文方法測(cè)定。結(jié)果表明加熱回流30、45、60min含量基本無差別,為確保提取完全的同時(shí)節(jié)約資源,故選擇提取時(shí)間為45分鐘(結(jié)果見表2)。
表2 不同提取時(shí)間的含量測(cè)定結(jié)果
2.2.3提取溶劑的考察
取同一批樣品適量,分別用50%甲醇、80%甲醇、甲醇為提取溶劑,按正文方法試驗(yàn)。結(jié)果表明不同濃度的甲醇對(duì)樣品含量測(cè)定有影響,為確保提取率選用80%甲醇作為提取溶劑(見表3)。
表3 不同提取溶劑的含量測(cè)定結(jié)果
3方法學(xué)考察
3.1線性關(guān)系考察
精密量取適當(dāng)濃度的混合對(duì)照品溶液,分別注入液相色譜儀,按擬定的色譜條件測(cè)定,以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),峰面積積分值的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,人參皂苷Rg1在22.93μg~229.32μg之間呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為y=1.508x+26.28(r=1);人參皂苷Re在110.80μg~886.38μg之間呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為y=1.566x+26.62(r=1);擬人參皂苷F11在24.14μg~241.44μg之間呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為y=1.573x+27.00(r=0.999);人參皂苷Rb1在0.144mg~1.152mg之間呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為y=1.575x+26.90(r=0.999)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。
表4 線性關(guān)系考察結(jié)果
3.3重復(fù)性試驗(yàn)
取同一批樣品,研細(xì),取0.5g、1.0g、1.5g各三份,精密稱定,按供試品溶液制備方法制成供試品溶液,按正文方法測(cè)定。結(jié)果表明,本方法重復(fù)性良好(結(jié)果見表5-6)。
表5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果1
表6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果2
3.4回收率試驗(yàn)
取已知含量的樣品(含量見重復(fù)性結(jié)果)粉末9份,每份約0.25g,精密稱定,每三份為一組,分別加入用80%甲醇配制的低、中、高三個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液25ml,按供試品溶液制備項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按正文方法測(cè)定,計(jì)算回收率。結(jié)果見表7-10。表明本方法回收率較好。
表7 人參皂苷Rg1回收率試驗(yàn)結(jié)果
表8 人參皂苷Re回收率試驗(yàn)結(jié)果
表9 人參皂苷Rb1回收率試驗(yàn)結(jié)果
表10 擬人參皂苷F11回收率試驗(yàn)結(jié)果
3.5穩(wěn)定性試驗(yàn)
取同一份供試品溶液,于0小時(shí)開始測(cè)定,以后間隔一段時(shí)間測(cè)定一次,記錄峰面積。結(jié)果表明,供試品溶液至少在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定(結(jié)果見表11)。
表11 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果
3.6樣品測(cè)定
取收集到的西洋參藥材共10批,依法測(cè)定,計(jì)算含量,結(jié)果見表12。
表12 西洋參樣品含量測(cè)定結(jié)果
附圖說明
圖1西洋參中四種人參皂苷類成分含量測(cè)定色譜圖(峰1人參皂苷Rg1、峰2人參皂苷Re、峰3擬人參皂苷F11、峰4人參皂苷Rb1);
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈為流動(dòng)相A,以0.01%甲酸為流動(dòng)相B,進(jìn)行梯度洗脫,洗脫梯度為:0-6分鐘,流動(dòng)相A由18%漸變至21%;6-10分鐘,流動(dòng)相A由21%漸變至30%;10-18分鐘,流動(dòng)相A為30%漸變至35%;18-20分鐘,流動(dòng)相A為35%漸變至55%;蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,氣壓40psi,增益100,漂移管溫度60℃,流速0.4ml/min;柱溫為40℃;
對(duì)照品溶液的制備
取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Re對(duì)照品、擬人參皂苷F11和人參皂苷Rb1適量,精密稱定,加80%甲醇分別制成每1ml含人參皂苷Rg1為20μg、人參皂苷Re為800μg、擬人參皂苷F11為40μg、人參皂苷Rb1為900μg的混合溶液,即得;
供試品溶液的制備取西洋參,粉碎,過4號(hào)篩,取1.0g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入80%甲醇25ml,密塞,搖勻,稱定重量,加熱回流45min,放冷,再稱定重量,用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,即得;
測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各2μl,注入液相色譜儀,測(cè)定,以外標(biāo)法計(jì)算含量,即得。
實(shí)施例2
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈為流動(dòng)相A,以0.01%甲酸為流動(dòng)相B,進(jìn)行梯度洗脫,洗脫梯度為:0-6分鐘,流動(dòng)相A由18%漸變至21%;6-10分鐘,流動(dòng)相A由21%漸變至30%;10-18分鐘,流動(dòng)相A為30%漸變至35%;18-20分鐘,流動(dòng)相A為35%漸變至55%;蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,氣壓40psi,增益100,漂移管溫度60℃,流速0.4ml/min;柱溫為40℃;
對(duì)照品溶液的制備
取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Re對(duì)照品、擬人參皂苷F11和人參皂苷Rb1適量,精密稱定,加80%甲醇分別制成每1ml含人參 皂苷Rg1為20μg、人參皂苷Re為800μg、擬人參皂苷F11為40μg、人參皂苷Rb1為900μg的混合溶液,即得;
供試品溶液的制備取西洋參,粉碎,過4號(hào)篩,取1.0g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入80%甲醇25ml,密塞,搖勻,稱定重量,加熱回流30min,放冷,再稱定重量,用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,即得;
測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各2μl,注入液相色譜儀,測(cè)定,以外標(biāo)法計(jì)算含量,即得。。
實(shí)施例3
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈為流動(dòng)相A,以0.01%甲酸為流動(dòng)相B,進(jìn)行梯度洗脫,洗脫梯度為:0-6分鐘,流動(dòng)相A由18%漸變至21%;6-10分鐘,流動(dòng)相A由21%漸變至30%;10-18分鐘,流動(dòng)相A為30%漸變至35%;18-20分鐘,流動(dòng)相A為35%漸變至55%;蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,氣壓40psi,增益100,漂移管溫度60℃,流速0.4ml/min;柱溫為40℃;
對(duì)照品溶液的制備
取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Re對(duì)照品、擬人參皂苷F11和人參皂苷Rb1適量,精密稱定,加80%甲醇分別制成每1ml含人參皂苷Rg1為20μg、人參皂苷Re為800μg、擬人參皂苷F11為40μg、人參皂苷Rb1為900μg的混合溶液,即得;
供試品溶液的制備取西洋參,粉碎,過4號(hào)篩,取1.0g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入80%甲醇25ml,密塞,搖勻,稱定重量,加熱回流60min,放冷,再稱定重量,用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,即得;
測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各1μl,注入液相色譜儀,測(cè)定,以外標(biāo)法計(jì)算含量,即得。。
上述實(shí)施例均按照藥典進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,結(jié)果顯示方法準(zhǔn)確可靠、靈敏、專屬,各項(xiàng)指標(biāo)均符合質(zhì)量控制的要求。