本發(fā)明涉及一種百草枯的檢測方法，尤其涉及一種利用表面增強拉曼光譜檢測百草枯的方法。

背景技術(shù)：

隨著科技的進步，農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)中的使用日益變得廣泛。但農(nóng)藥在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留給人身安全帶來危害。農(nóng)產(chǎn)品中殘留的農(nóng)藥被食用后，在人體內(nèi)部逐步積累，引起慢性中毒危害人身安全。

百草枯作為速效觸殺型滅生性季胺鹽類除草劑，具有高效除草效果，廣泛應用于果蔬莊稼作物種植過程中。目前全世界超過130個國家和地區(qū)在大量使用含百草枯成份的農(nóng)藥。由于百草枯的化學分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易降解，在農(nóng)藥施用后很長時間存留在植物組織中。并且由于百草枯具有強水溶性，使得百草枯施用后能夠長時間殘留在土壤水體中，隨植物的蒸騰作用被運輸?shù)街参锔鱾€組織中，造成農(nóng)產(chǎn)品的污染。由于百草枯對人和牲畜有較強的生理毒性且無特效解藥，世界范圍內(nèi)每年均有百草枯急性或慢性致死案例。由于百草枯相比于同類農(nóng)藥具有更高的效果，因而終止百草枯在世界范圍內(nèi)的使用是不現(xiàn)實的，因而加強對農(nóng)產(chǎn)品中百草枯的檢測，對世界衛(wèi)生安全具有重要的現(xiàn)實意義。

現(xiàn)有技術(shù)中百草枯的檢測方法主要包括酶聯(lián)免疫法(ELISA)、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)、紫外分光光度法和生物傳感器法等。主流的檢測手段主要采用色譜-質(zhì)譜手段對百草枯分子進行分離和識別，由于百草枯是一種強極性離子型化合物，能夠?qū)ιV柱和質(zhì)譜離子源造成損害，縮短儀器壽命，提高檢測成本。美國分析化學家協(xié)會(AOAC)現(xiàn)行推薦的百草枯檢測方法需要對百草枯陽離子進行還原反應，衍生化后進行檢測，提取步驟十分復雜，需要在硫酸中回流5h以上，操作復雜。由于色譜-質(zhì)譜法檢測前處理程序復雜、操作繁瑣、耗時長、檢測成本高，而而酶聯(lián)免疫法容易產(chǎn)生假陽性和假陰性結(jié)果，生物傳感器法檢測結(jié)果的準確性和穩(wěn)定性還有待提高。所以現(xiàn)有技術(shù)所提供的檢測百草枯的方法并不能實現(xiàn)對百草枯快速、廉價、準確和靈敏的檢測。

拉曼光譜分析技術(shù)是基于印度科學家C.V.拉曼所發(fā)現(xiàn)的拉曼散射效應，對與入射光頻率不同的散射光譜進行分析以得到分子振動、轉(zhuǎn)動方面信息，并應用于分子結(jié)構(gòu)研究的一種分析方法。表面增強拉曼光譜(Surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)技術(shù)采用經(jīng)特殊處理表面粗糙化的金屬，通過把被分析有機物吸附在粗糙金屬表面，使得被分析物的拉曼散射信號增強10⁵～10¹⁴，從而克服常規(guī)激光拉曼光譜技術(shù)靈敏度低的缺點。SERS技術(shù)為食品及復雜生物體系中痕量物質(zhì)的快速、靈敏檢測提供一種新的途徑，被廣泛應用于痕量有機分子的分析?，F(xiàn)有技術(shù)中采用銀納米粒子溶膠利用SERS檢測技術(shù)對百草枯分子進行檢測，檢測限可達到0.1mg/mL，但低于0.1mg/mL濃度的百草枯含量依然能通過積累效應對人體產(chǎn)生毒害。

果汁、蔬菜汁等飲料成分復雜，會對檢測基底產(chǎn)生干擾，影響檢測結(jié)果靈敏度。因此需要對現(xiàn)有技術(shù)加以改進，能夠快速、高效、準確的測定出果汁等樣品中痕量的百草枯。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種利用表面增強拉曼光譜檢測百草枯的方法，該方法能夠簡便快捷的實現(xiàn)樣品尤其是飲料中百草枯含量的準確檢測，并且靈敏度好，選擇性高。

本發(fā)明技術(shù)方案為：一種利用表面增強拉曼光譜檢測百草枯的方法，步驟包括：

(1)待測樣品用弱陽離子交換樹脂預處理，收集洗脫液；

(2)用金納米顆粒溶膠做基底，通過表面增強拉曼光譜檢測洗脫液。

待測樣品為果汁、蔬菜汁或者其混合物，尤其是蘋果汁。且待測樣品中不含固體懸浮物。

待測樣品中糖含量為8wt％～20wt％，糖酸比為10～15：1。優(yōu)選的，樣品中糖含量為10wt％～13wt％，糖酸比為11～14：1。

進一步，步驟(1)所述預處理的步驟包括：

a.用體積比為0.5～1.5：1的甲醇與超純水的混合液作為活化液，對弱陽離子交換樹脂柱進行活化；

b.將待檢測樣品上樣；

c.用淋洗液進行淋洗；所述的淋洗液為體積比0.5～1.5：1的甲醇與水的混合液；

d.用洗脫劑進行洗脫，并收集洗脫液；所述的洗脫劑為體積比1.5～2.5：70～100：9～16的甲酸、甲醇和水的混合液。

所述活化液、待測樣品、淋洗液、洗脫劑的體積比為4～8：5：2～4：1～3；所述活化液中甲醇與水的體積比為0.5～1.5：1；所述淋洗液中甲醇與水的體積比為0.5～1.5：1；所述洗脫劑中甲酸、甲醇與水的體積比為1.5～2.5：70～100：9～16。

優(yōu)選的，所述活化液、待測樣品、淋洗液、洗脫劑的體積比為5～7：5：2.5～3.5：1.5～2.5；所述活化液中甲醇與水的體積比為0.9～1.1：1；優(yōu)選的，所述淋洗液中甲醇與水的體積比為0.9～1.1：1；優(yōu)選的，所述洗脫劑中甲酸、甲醇與水的體積比為1.8～2.2：80～90：11～15。

更為優(yōu)選的，所述活化液、待測樣品、淋洗液、洗脫劑的體積比為6：5：3：2；所述活化液中甲醇與水的體積比為1：1；更為優(yōu)選的，所述淋洗液中甲醇與水的體積比為1：1；更為優(yōu)選的，所述洗脫劑中甲酸、甲醇與水的體積比為2：85：13。

進一步，步驟(1)所述的預處理步驟還包括：弱陽離子交換樹脂柱洗脫得到的洗脫液用孔徑為0.2～0.3μm濾膜過濾。

優(yōu)選的，所述金納米顆粒溶膠粒徑為64±6nm。

進一步，所述金納米顆粒溶膠的制備方法包括以下步驟：將氯金酸溶液加熱至沸騰，加入檸檬酸三鈉溶液后攪拌并保持沸騰10～25min。更優(yōu)選的，可將產(chǎn)物冷卻離心，棄去上清液，得到金納米顆粒溶膠(離心濃縮倍數(shù)約5～20倍)。

所述氯金酸、檸檬酸三鈉的質(zhì)量比為1：0.5～1.5，優(yōu)選為1：0.6～1；所述檸檬酸三鈉溶液的濃度為0.5wt％～1.5wt％，優(yōu)選為0.8wt％～1.2wt％；所述氯金酸溶液的濃度為0.005wt％～0.015wt％，優(yōu)選為0.009wt％～0.011wt％。

進一步，所述金納米顆粒溶膠的制備方法包括以下步驟：將濃度為0.01wt％的氯金酸溶液加熱至沸騰，加入濃度為1wt％檸檬酸三鈉溶液后攪拌并保持沸騰12～15min；氯金酸溶液與檸檬酸三鈉溶液的體積比為100：0.7；產(chǎn)物冷卻離心，棄去上清液，得到金納米顆粒溶膠(離心濃縮倍數(shù)約5～20倍)。

進一步，所述表面增強拉曼光譜檢測中采用的激光波長優(yōu)選為780nm，掃描范圍優(yōu)選為550～2000cm^-1。

在1645±5cm^-1特征峰下，峰強度與百草枯濃度線性相關(guān)。測定不同百草枯濃度的標準樣品表面增強拉曼光譜強度，繪制標準曲線，采用標準曲線法定量檢測待測樣品中百草枯的濃度。

本發(fā)明的有益效果在于，提供了一種利用表面增強拉曼光譜檢測百草枯的方法，果汁、蔬菜汁等樣品經(jīng)過弱陽離子交換樹脂預處理，然后采用金納米顆粒溶膠做基底，通過表面增強拉曼光譜檢測樣品中百草枯。在1645±5cm^-1下，峰強度與百草枯濃度線性相關(guān)，從而可以對百草枯進行定量檢測。該方法能夠快速、有效地定性或定量檢測樣品中百草枯。

本發(fā)明的方法靈敏度高，檢測限低，能夠有效定性或定量檢測出果汁等樣品中殘留的百草枯，檢測限0.02μg/mL，優(yōu)于歐盟的最低檢測限標準(0.05μg/mL)，而未經(jīng)過弱陽離子交換樹脂預處理的樣品，百草枯含量的檢測限為5μg/mL。因此本技術(shù)方案實現(xiàn)了百草枯農(nóng)藥的實用、快速、高效、低成本檢測。

附圖說明

圖1為百草枯標準品的拉曼光譜；

圖2為實施例1金納米顆粒TEM圖；

圖3為百草枯標準溶液SERS譜圖；

圖4為經(jīng)過WCX柱預處理的含百草枯蘋果汁SERS譜圖；

圖5為蘋果汁中百草枯含量的定量分析模型；

圖6為直接混合法測定蘋果汁中百草枯SERS譜圖；

圖7為采用不同尺寸金納米顆粒為基底的百草枯標準溶液SERS譜圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例和附圖，進一步闡述本發(fā)明。實施例中所采用的蘋果汁含糖量在12～13g/100mL之間，糖酸比在13～15：1范圍內(nèi)。

實施例1 金納米顆粒溶膠的制備

將100mL濃度為0.01wt％的氯金酸溶液倒入燒瓶中，放在恒溫磁力攪拌器上，1100rpm劇烈攪拌并加熱至溶液沸騰，然后加入0.7mL濃度為1wt％的檸檬酸三鈉溶液，同時以1100rpm劇烈攪拌并保持沸騰15min，冰浴迅速結(jié)束反應，待反應液冷卻后，取15mL離心后棄除上層清液(約14mL)，取下層的金納米顆粒水溶膠，用于后續(xù)的檢測。

對所制備的金納米顆粒進行檢測，結(jié)果如圖2，所制備的金納米顆粒平均粒徑為64±6nm，尺寸均勻，分散度好。

實施例2 百草枯標準溶液的檢測

首先配制梯度濃度的百草枯標準水溶液(10μg/L、5μg/L、2μg/L、1μg/L、0.5μg/L、0.2μg/L、0μg/L)，將標準水溶液用0.22μm濾膜過濾后，取50μL置于1.5mL離心管中，加入等體積的金納米顆粒溶膠(實施例1制備)混合，渦旋振蕩10s后，取5μL混合液滴加至干凈的硅片上，烘干后采用顯微拉曼光譜儀進行表面增強拉曼光譜測定。顯微拉曼光譜儀功率為80mW，激光波長為780nm，采集的波譜范圍為550～2000cm^-1。

梯度濃度的百草枯標準溶液測試結(jié)果如圖3所示，百草枯標準品的拉曼譜圖如圖1所示。根據(jù)圖3分析可知，本技術(shù)方案所提供的SERS技術(shù)對百草枯標準溶液的最低檢出濃度為0.2μg/L，說明以金納米顆粒溶膠作為基底的SERS檢測百草枯的方法具有高靈敏性。

實施例3 蘋果汁中百草枯的直接測定

蘋果汁中加入百草枯母液，配制0～20μg/mL梯度濃度的百草枯的蘋果汁樣品并經(jīng)過0.22μm濾膜過濾，取50μL置于1.5mL離心管中，加入等體積金納米顆粒溶膠(實施例1制備混合)，振蕩10s后，取5μL滴在干凈硅片上，烘干，采用顯微拉曼光譜儀進行測定。顯微拉曼光譜儀功率80mW，激光波長780nm，掃描范圍550～2000cm^-1。

所獲得的SERS譜圖如圖6所示，可以看出采用直接混合法測定蘋果汁中百草枯含量，最低檢測濃度為5μg/mL。

實施例4 用弱陽離子交換樹脂預處理蘋果汁樣品并檢測百草枯

(一)用弱陽離子交換樹脂預處理蘋果汁樣品

蘋果汁中加入百草枯母液，配制梯度濃度的含百草枯的蘋果汁(百草枯濃度分別為0.02μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL)，然后將含有百草枯的蘋果汁用CNWBOND WCX弱陽離子交換SPE小柱(60mg，3mL；上海安譜實驗科技股份)預處理。

具體操作為：①取6mL等體積比的甲醇-超純水混合液對WCX小柱進行活化；

②取5ml待測的蘋果汁上樣；

③取3ml等體積比的甲醇-水溶液進行淋洗；

④取2ml甲酸-甲醇-水進行洗脫，其中甲酸、甲醇和水的體積比為2：85：13；并且采用孔徑為0.22μm的PVDF針式濾膜過濾洗脫液。

(二)蘋果汁中百草枯含量的測定

將所得洗脫液與等體積的金納米顆粒溶膠(實施例1制備)混合，然后渦旋振蕩10秒鐘，得到檢測溶液。

取5μL檢測溶液滴加到干凈的硅片上，并烘干，然后通過顯微拉曼光譜儀進行測定。顯微拉曼光譜儀功率為80mW，激光波長為780nm，采集的波譜范圍為550～2000cm^-1，SERS譜圖如圖4所示。

結(jié)合圖4的SERS譜圖可知，百草枯的最強特征峰為1646cm^-1，在該特征峰下繪制的工作曲線如圖5所示，并可得出1646cm^-1下峰強度與百草枯濃度線性相關(guān)，R²為0.982，均方根誤差為0.04，相對分析誤差為7.50。根據(jù)圖4可知，采用金納米顆粒溶膠做SERS檢測的基底檢測蘋果汁中的百草枯，檢測限可以達到0.02μg/mL，優(yōu)于歐盟設(shè)定的蘋果汁中百草枯最低檢出濃度(0.05μg/mL)。

與百草枯標準水溶液的檢測限(0.2μg/L)相比，經(jīng)過弱陽離子交換樹脂小柱(WCX)處理后，蘋果汁中百草枯的含量檢測限為0.02μg/mL，而未經(jīng)預處理的蘋果汁，直接進行表面增強拉曼光譜檢測的檢測限為5μg/mL(如圖6)。這是由于蘋果汁中的除了水之外的主要成分諸如糖、氨基酸、有機酸、色素等有機分子會對表面增強拉曼光譜檢測方法造成干擾。將蘋果汁經(jīng)過弱陽離子交換樹脂小柱(WCX)處理后，所得到的洗脫液中糖、氨基酸、有機酸、色素分子含量降低，減少了對百草枯分子的拉曼光譜干擾。將圖4與圖6相比，可以看出未經(jīng)過弱陽離子交換樹脂小柱處理的蘋果汁做得到的測試譜圖基線波動很大，雜峰較多；而經(jīng)過弱陽離子交換樹脂小柱處理后，如圖4所示，極限很平整，并且雜峰數(shù)量減少，有效提高了檢測靈敏度。

由于果汁成分來自于植物果皮細胞中液泡內(nèi)部的細胞液，無論何種水果，其果汁主要成分均為糖、氨基酸、有機酸、色素和水。因此本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員有理由相信本具體實施方式用于蘋果汁的檢測方法對多種果汁、蔬菜汁均具有普適性。

實施例5 金納米顆粒尺寸對百草枯檢測靈敏度的影響

按實施例1的方法，通過改變檸檬酸三鈉的用量，得到粒徑大小不同的金納米顆粒溶膠。分別取粒徑23nm、49nm和102nm的金納米顆粒溶膠，以及實施例1所制備的64±6nm金納米顆粒溶膠，然后與等體積0.05μg/mL的百草枯標準水溶液混合，渦旋10s。取5μL混合液滴加至干凈的硅片上，烘干后進行表面增強拉曼光譜測定。顯微拉曼光譜儀功率為80mW，激光波長為780nm，采集的波譜范圍為550～2000cm^-1。

測試結(jié)果如圖7所示，根據(jù)圖7分析可知，當金納米顆粒尺寸處于64±6nm時，所測得的表面增強拉曼光譜的特征峰強度最大，因此采用粒徑64±6nm的金納米顆粒溶膠進行百草枯的檢測最為靈敏。

需要指出的是，上述實施例僅為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項目技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。