本發(fā)明涉及分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人血漿中熊去氧膽酸的定量檢測方法。

背景技術(shù)：

熊去氧膽酸(ursodexycholic acid)是一種親水膽汁酸，在生理情況下，熊去氧膽酸占人體膽汁酸的比例不超過2％。研究表明，熊去氧膽酸能有效溶解膽固醇性結(jié)石，有利膽、保護(hù)肝細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)等作用，長期服用能夠增加膽汁酸分泌，并使膽汁成分改變，降低膽汁中膽固醇及膽固醇脂，有利于膽結(jié)石中的膽固醇逐漸溶解，可明顯緩解癥狀，改善脂肪肝影像學(xué)表現(xiàn)，用于不宜手術(shù)治療的膽固醇結(jié)石，對(duì)脂肪肝具有較好療效，而且不良反應(yīng)輕，使用安全；對(duì)結(jié)腸癌化療引起的腹瀉、預(yù)防和治療肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)、各種肝病的輔助治療、膽汁返流性胃炎和原發(fā)性膽汁性肝硬化的治療等有較好療效，被廣泛用于臨床多種肝膽疾病的治療。

由于液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜(LC-MS/MS)法可以克服背景干擾，對(duì)復(fù)雜樣品仍可達(dá)到很高的靈敏度，且具有分辨率高、質(zhì)量范圍寬、掃描快等優(yōu)點(diǎn)，LC-MS/MS已成為現(xiàn)代分析手段中必不可少的組成部分。為此本發(fā)明建立了一種快速、靈敏的LC-MS/MS方法定量檢測人血漿中熊去氧膽酸的濃度，并將該方法應(yīng)用于熊去氧膽酸的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究，為熊去氧膽酸的臨床研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)。因此建立熊去氧膽酸的LC-MS/MS分析方法，有助于服務(wù)制藥企業(yè)，縮短其一致性評(píng)價(jià)的研究周期，高效嚴(yán)謹(jǐn)便捷準(zhǔn)確的進(jìn)行樣品分析。使老百姓吃到安全，有效又便宜的藥。

建立通用、簡單、快捷、準(zhǔn)確的熊去氧膽酸血漿樣品分析定量檢測方法，有助于準(zhǔn)確快速的研究該化合物的藥代動(dòng)力學(xué)特征，獲得相應(yīng)的PK參數(shù)，為熊去氧膽酸的一致性評(píng)價(jià)建立基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種人血漿中熊去氧膽酸的定量檢測方法，該方法采用沉淀前處理、LC-MS/MS質(zhì)譜儀進(jìn)行測定，操作簡單、分離效果好、定性準(zhǔn)確、樣品分析時(shí)間短、檢測靈敏度高。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種人血漿中熊去氧膽酸的定量檢測方法，包括如下步驟：

(1)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：稱取熊去氧膽酸對(duì)照品至玻璃瓶中，加入甲醇配制成濃度為2～10mg·mL-1的熊去氧膽酸儲(chǔ)備液，將所述熊去氧膽酸儲(chǔ)備液用體積比1:1的甲醇水溶液稀釋成濃度為0.1～5000μg·mL-1的熊去氧膽酸工作溶液；稱取一定量的內(nèi)標(biāo)熊去氧膽酸-d4至玻璃瓶中，加入甲醇配制成濃度為0.300～0.800mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，用體積比1:1的甲醇水溶液稀釋成200～600ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作溶液；所有儲(chǔ)備液及工作溶液在0～10℃下保存，備用；

(2)血漿樣品前處理過程：取20.0～60.0μL人血漿樣品，向樣品中加入步驟(1)所述的內(nèi)標(biāo)工作溶液，然后加入乙腈沉淀劑，渦旋混合，于3～8℃的離心機(jī)中高速離心3～5分鐘；取上清液并向上清液中加入體積比1:1的甲醇水溶液，渦旋混合3～5分鐘，進(jìn)行LC-MS/MS分析；

(3)標(biāo)準(zhǔn)及曲線配制過程：等量取步驟(1)所述各濃度熊去氧膽酸工作溶液，分別加入到犬空白血漿中渦旋混勻，配制成校正標(biāo)樣及隨行質(zhì)控樣品，然后分別注入LC-MS/MS中進(jìn)行測定，以熊去氧膽酸和內(nèi)標(biāo)熊去氧膽酸-d4的色譜峰面積比為縱坐標(biāo)，以人血漿中熊去氧膽酸的濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(4)LC-MS/MS測定過程：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算人血漿樣品中的熊去氧膽酸濃度。

進(jìn)一步地，所述LC-MS/MS測定過程工作條件為：

a.液相色譜條件：色譜柱為UItimateXB C18；流動(dòng)相A：含0.05％甲酸和10mM乙酸銨的水溶液；流動(dòng)相B：乙腈；柱溫箱溫度：30～50℃；流速：0.2～0.8mL/min；色譜柱平衡狀態(tài)時(shí)的柱壓：20.0～24.0MPa；洗脫方式為梯度洗脫；

b.質(zhì)譜條件：離子源為ESI源，采用負(fù)離子模式、多反應(yīng)監(jiān)測模式；電噴霧電壓：-5000～-4000V；渦旋離子噴霧溫度：550～650℃；氣簾氣種類：30psi；碰撞池氣體：中級(jí)；霧化氣種類Gas1：40psi；輔助氣Gas 2：50psi；數(shù)據(jù)收集時(shí)間：3～6min。

優(yōu)選地，步驟(2)所述離心機(jī)轉(zhuǎn)速≥10000×g。

優(yōu)選地，所述LC-MS/MS測定過程中熊去氧膽酸的監(jiān)測離子對(duì)為391.2/391.2，每次掃描一個(gè)離子對(duì)時(shí)所停留的時(shí)間200msec，去簇電壓-137eV，碰撞能量-5.00eV。

優(yōu)選地，所述LC-MS/MS測定過程中內(nèi)標(biāo)熊去氧膽酸-d4的監(jiān)測離子對(duì)為395.3/395.3，每次掃描一個(gè)離子對(duì)時(shí)所停留的時(shí)間100msec，去簇電壓-32.0eV，碰撞能量-13.0eV。

優(yōu)選地，步驟(3)所述校正標(biāo)樣有8～10個(gè)，濃度為20.0～20000ng·mL^-1。

優(yōu)選地，步驟(3)所述隨行質(zhì)控樣品由低、中、高及DQC的四個(gè)濃度組成；其中所述DQC隨行質(zhì)控樣品濃度為10000ng·mL-1，稀釋因子為10。

進(jìn)一步地，所述色譜條件還包括：自動(dòng)進(jìn)樣器清洗溶液為甲醇，壓腳提升量：48mm；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：4.0℃；自動(dòng)進(jìn)樣器清洗模式：進(jìn)樣前清洗和進(jìn)樣后清洗；自動(dòng)進(jìn)樣器洗針體積：400μL；自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣針清洗時(shí)浸泡時(shí)間：2seconds；自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣體積：15.0μL。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：1、本發(fā)明采用多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行定性和定量，能夠有效提高定性準(zhǔn)確度和方法的靈敏度，最低檢測限可達(dá)到納克級(jí)水平，分析時(shí)間短，所需樣品量更少；2、本發(fā)明在人血漿樣品中加入乙腈沉淀劑，較傳統(tǒng)固相萃取前處理方法，操作更簡單，處理速度快，引進(jìn)誤差小，分離效果好，檢測效率高；3、本發(fā)明利用校正標(biāo)樣及隨行質(zhì)控樣品確定標(biāo)準(zhǔn)曲線，提高了檢測的精密度和準(zhǔn)確度，確保定性定量分析結(jié)果可靠。

附圖說明

圖1：人血漿中熊去氧膽酸濃度測定的代表性標(biāo)準(zhǔn)曲線

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例及附圖，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)耗材與儀器：

分析天平：BT125D十萬分之一電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司

離心機(jī)：Thermo FisherSorvall Legend Micr 17R高速離心機(jī)，美國賽默飛世爾

超聲清洗器：KQ5200E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司

移液器：0.5-10μL，2-20μL，20-200μL，100-1000μL，Eppendorf

玻璃樣品瓶及螺旋蓋：3.0mL，5.0mL，7.0mL，10.0mL，20.0mL，30.0mL，60.0mL，100mL，南通疊泰實(shí)驗(yàn)儀器有限公司

96孔深孔板：P-DW-20-C，2.00mL，美國愛思進(jìn)公司(AXYGEN)

96孔深孔板密封墊：P-DW-20-C，2.00mL，美國愛思進(jìn)公司(AXYGEN)

聚丙烯離心管：1.5mL，?？死箤?shí)驗(yàn)器材有限公司

高效液相色譜泵：LC-20ADXR，Shimadzu公司

自動(dòng)進(jìn)樣器：SIL-20ACXR，Shimadzu公司

柱溫箱：CTO-20AC，Shimadzu公司

質(zhì)譜儀：QTRAP4500，ABSciex公司

實(shí)施例

人血漿中熊去氧膽酸濃度LC-MS/MS測定方法的建立：

(1)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：分別精密稱取兩份一定量的熊去氧膽酸對(duì)照品至玻璃瓶中，精密加入一定體積的甲醇配制成濃度為5.00mg·mL-1的儲(chǔ)備液，標(biāo)記為S01-1與S01-2。稱取一定量的熊去氧膽酸-d4(內(nèi)標(biāo))至玻璃瓶中，精密加入一定體積的甲醇，配制成濃度為0.500mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液；所有儲(chǔ)備液保存在6℃冰箱中，備用；將配制好的熊去氧膽酸儲(chǔ)備液用體積比1：1的甲醇水溶液逐級(jí)稀釋成濃度為500、400、250、50.0、20.0、5.00、1.00和0.500μg·mL-1的熊去氧膽酸工作溶液，用于配制校正標(biāo)樣；將平行稱量配制的另一份熊去氧膽酸儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋成濃度為2500、375、25.0和1.50μg·mL-1的熊去氧膽酸工作溶液，用于配制質(zhì)控樣品。用體積比1：1的甲醇水溶液將熊去氧膽酸-d4(內(nèi)標(biāo))儲(chǔ)備液稀釋成400ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作溶液；所有的工作溶液保存在6℃冰箱中，備用。

(2)血漿樣品前處理過程：取40.0μL人血漿樣品，加入20.0μL內(nèi)標(biāo)工作溶液，然后加入300μL乙腈沉淀劑，渦旋混合5分鐘，樣品于4℃的離心機(jī)中以10000×g離心5分鐘。轉(zhuǎn)移100μL上清液至裝有100μL體積比1：1的甲醇水溶液的96孔板中，渦旋混合5分鐘，進(jìn)行LC-MS/MS分析；

(3)標(biāo)準(zhǔn)及曲線配制過程：取10.0μL步驟(1)所述熊去氧膽酸工作溶液，加入到240μL犬空白血漿中，渦旋混勻，配制成20000、16000、10000、2000、800、200、40.0和20.0ng·mL-1的校正標(biāo)樣，及100000ng·mL-1、15000ng·mL-1(HQC)、1000ng·mL-1(MQC)和60.0ng·mL-1(LQC)的質(zhì)控樣品，取20.0μL 100000ng·mL-1的質(zhì)控樣品加入到180μL的犬空白血漿中，配制成10000ng·mL-1的DQC樣品，用以考察稀釋可靠性；將校正標(biāo)樣及隨行質(zhì)控樣品，分別注入LC-MS/MS中進(jìn)行測定。熊去氧膽酸和內(nèi)標(biāo)熊去氧膽酸-d4的色譜圖采集和色譜峰積分由軟件Analyst1.6.2(AB Sciex)進(jìn)行處理，分別以熊去氧膽酸和內(nèi)標(biāo)熊去氧膽酸-d4的色譜峰面積比為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(W＝1/x2)最小二乘法以血漿中熊去氧膽酸的濃度(X)與峰面積比(Y)進(jìn)行線性回歸，所得的回歸方程(Y＝a+bX)即為標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算人血漿樣品中的熊去氧膽酸濃度。

(4)LC-MS/MS測定過程工作條件為：

a.液相色譜條件：

色譜柱：UItimateXB C18(50.0×2.1mm，1.70μm，Welch，China)

流動(dòng)相A：含0.05％甲酸和10mM乙酸銨的水溶液

流動(dòng)相B：乙腈

自動(dòng)進(jìn)樣器清洗溶液：甲醇

柱溫箱溫度：40℃

流速：0.4mL/min

色譜柱平衡狀態(tài)時(shí)的柱壓：22.0MPa(Typical)

自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：4.0℃

壓腳提升量：48mm

自動(dòng)進(jìn)樣器清洗模式：進(jìn)樣前清洗和進(jìn)樣后清洗

自動(dòng)進(jìn)樣器洗針體積：400μL

自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣針清洗時(shí)浸泡時(shí)間：2seconds

自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣體積：15.0μL

洗脫梯度：

b.質(zhì)譜條件：

離子化模式：負(fù)離子模式，Electrospray Ionization(ESI)

掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)

電噴霧電壓：-4500V

渦旋離子噴霧溫度：600℃

氣簾氣種類：氮?dú)?設(shè)置：30

碰撞池氣體種類：氮?dú)?設(shè)置：中級(jí)

霧化氣種類：氮?dú)?設(shè)置：40

輔助氣種類：氮?dú)?設(shè)置：50

噴針位置：Y＝5.00mm X＝5.00mm

數(shù)據(jù)收集時(shí)間：4.5minutes

*注明：停留時(shí)間，此處指的是在監(jiān)測離子對(duì)時(shí)，每次掃描一個(gè)離子對(duì)時(shí)所停留的時(shí)間。

(5)分析結(jié)果：以熊去氧膽酸和內(nèi)標(biāo)熊去氧膽酸-d4的峰面積比為縱坐標(biāo)，人血漿中熊去氧膽酸的濃度(ng·mL-1)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。熊去氧膽酸的代表性標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝0.00518x+0.0586(r＝0.9974)(如附圖1)，結(jié)果表明熊去氧膽酸在10.0～10000ng·mL-1范圍內(nèi)線性良好。

應(yīng)用例

本應(yīng)用例對(duì)上述實(shí)施例中LC-MS/MS方法測定人血漿中熊去氧膽酸濃度的準(zhǔn)確度、精密度進(jìn)行評(píng)價(jià)。取20.0μL上述DQC、HQC、MQC、LQC四個(gè)濃度的質(zhì)控樣品各一份，按上述方法操作，于1日內(nèi)每個(gè)濃度5個(gè)樣品重復(fù)測定5次，并分別在不同天連續(xù)測定3個(gè)分析批，計(jì)算精密度，結(jié)果如下表所示：

本發(fā)明人血漿中熊去氧膽酸的定量檢測方法各項(xiàng)指標(biāo)均符合生物樣品分析測定要求，采用本發(fā)明能夠高效、嚴(yán)謹(jǐn)、便捷、準(zhǔn)確的進(jìn)行樣品分析，獲得相應(yīng)的PK參數(shù)，縮短熊去氧膽酸一致性評(píng)價(jià)的研究周期，研究人血漿中熊去氧膽酸的藥代動(dòng)力學(xué)特征，更好地為制藥企業(yè)服務(wù)，使老百姓吃到安全、有效又便宜的藥。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。