本發(fā)明涉及一種基于疏水離子交換固相萃取的牛肝菌中n-亞硝胺的提取及測(cè)定方法，屬于化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

煙草植物屬于茄科和煙草屬，煙草中含有煙草特有n-亞硝胺已經(jīng)是不爭(zhēng)的事實(shí)。煙草特有n-亞硝胺是胺類化合物在酸性條件下與亞硝化試劑反應(yīng)而生成的，是一類受到廣泛關(guān)注的致癌物質(zhì)，不僅是霍夫曼清單和美國食品藥品監(jiān)督管理局“煙草制品及煙氣中有害及潛在有害物質(zhì)名單”中的重要物質(zhì)，也是國際癌癥研究機(jī)構(gòu)“無煙氣煙草制品中28種有害物質(zhì)”名單中的重要成分。有報(bào)道稱牛肝菌等野生蘑菇中的尼古丁濃度高達(dá)0.5毫克/公斤。然而，牛肝菌中的煙堿是否會(huì)在一定條件下生成n-亞硝胺，目前鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。

申請(qǐng)公開號(hào)為cn102012407a的發(fā)明專利公開了一種煙草及煙草制品中煙草特有n-亞硝胺的檢測(cè)方法，在該方案中將萃取液流經(jīng)固相萃取小柱，然后采用甲酸水淋洗，最后用氨水/甲醇洗脫，得到待測(cè)液。該方案中的固相萃取填料為n-乙烯基吡咯烷酮-苯磺酸共聚物，有機(jī)聚合物填料在有機(jī)溶劑中會(huì)溶脹，會(huì)在一定程度上影響填料的富集和凈化效果。另外，該方案中也沒有對(duì)影響萃取效果的各種參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。而且煙草樣品的基質(zhì)與牛肝菌的基質(zhì)有很大差別，因此該方案中的技術(shù)方案可能不適用于牛肝菌樣品。

因此，開發(fā)一種牛肝菌中n-亞硝銨的提取及測(cè)定方法迫在眉睫。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于疏水離子交換固相萃取的牛肝菌中n-亞硝胺的提取方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種基于疏水離子交換固相萃取的牛肝菌中n-亞硝胺的測(cè)定方法。

為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種基于疏水離子交換固相萃取的牛肝菌中n-亞硝胺的提取方法，包括以下步驟：

1)將凍干磨成粉的牛肝菌加入濃度為5～100mmol/l的乙酸銨溶液進(jìn)行提取，得粗提取液；

2)將步驟1)所得的粗提取液流過經(jīng)活化處理后的hicaptmcx固相萃取柱，完成上樣；

3)用甲醇水溶液進(jìn)行淋洗；

4)用丙酮、丙酮氨水混合液、丙酮甲酸混合液中的任意一種進(jìn)行洗脫，即得n-亞硝胺的提取液；所述丙酮氨水混合液中丙酮、氨水的體積比為97～99:3～1；丙酮甲酸混合液中丙酮、甲酸的體積比為97～99:3～1；所述氨水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35％。

上述牛肝菌中n-亞硝胺包括nnn、nnk、nat和nab。

上述步驟1)中提取操作為：將凍干研磨成粉的牛肝菌加入濃度為5～100mmol/l的乙酸銨溶液中，進(jìn)行超聲處理，然后分離不溶物，得粗提取液。

上述每1g凍干研磨成粉的牛肝菌所用乙酸銨溶液的用量為10～100ml。

上述超聲處理，超聲功率280～700w，頻率20～40khz，時(shí)間≥10min。超聲時(shí)間優(yōu)選為10～60min。超聲時(shí)間進(jìn)一步優(yōu)選為30min。

上述分離不溶物采用過濾或離心的方式。

上述過濾采用水相濾膜。

上述水相濾膜的孔徑為0.20～0.50μm。優(yōu)選為0.22μm或0.45μm。

上述水相濾膜為聚醚砜膜。

上述離心，是將超聲處理后的混合液靜置，然后進(jìn)行離心，最后取上層清液。

上述靜置時(shí)間為3～10min。優(yōu)選為5min。

上述離心轉(zhuǎn)速5000～10000rpm，時(shí)間為3～10min。離心時(shí)間優(yōu)選為5min。

上述步驟2)中hicaptmcx固相萃取柱為疏水/離子交換混合保留機(jī)理固相萃取柱。上述hicaptmcx固相萃取柱購自于維泰克科技(武漢)有限公司。

上述步驟2)中hicaptmcx固相萃取柱具有疏水和強(qiáng)離子交換作用。

上述步驟2)中所用hicaptmcx固相萃取柱中的填料的用量為：每將6ml粗提取液完成上樣時(shí)，相應(yīng)使用50～1000mg的hicaptmcx固相萃取填料。優(yōu)選地，6ml粗提取液對(duì)應(yīng)使用500mghicaptmcx固相萃取填料。

上述粗提取液在上樣前調(diào)ph值至3.0～11。優(yōu)選為調(diào)ph值至4～6。

上述調(diào)節(jié)ph值的調(diào)節(jié)劑為乙酸或氨水。當(dāng)選用乙酸調(diào)節(jié)ph時(shí)，優(yōu)選質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的乙酸溶液。

上述活化處理操作為：依次用丙酮、甲醇水溶液、水流經(jīng)hicaptmcx固相萃取柱。

上述活化為依次用丙酮、甲醇體積分?jǐn)?shù)為5％的甲醇水溶液、水流經(jīng)hicaptmcx固相萃取柱。所述丙酮、甲醇水溶液、水的體積比為1:2:2。

上述步驟3)中甲醇水溶液中甲醇的體積分?jǐn)?shù)為5～20％。步驟3)中甲醇水溶液的用量選擇時(shí)，每將6ml粗提取液上樣，淋洗時(shí)甲醇水溶液的用量為≥0.5ml。優(yōu)選為1ml。

步驟3)中淋洗后在真空泵的負(fù)壓作用下抽干淋洗液。

上述步驟4)丙酮氨水混合液中丙酮與氨水的體積比優(yōu)選為99:1。

上述步驟4)丙酮甲酸混合液中丙酮與甲酸的體積比優(yōu)選為99:1。

步驟4)中洗脫，洗脫液的用量為：每將6ml粗提取液上樣，淋洗，干燥后使用的洗脫液體積≥0.5ml。優(yōu)選為1～2ml。進(jìn)一步優(yōu)選為1ml。

一種基于疏水離子交換固相萃取的牛肝菌中n-亞硝胺的測(cè)定方法，包括以下步驟：

1.n-亞硝胺提取液的制備

1.1在凍干磨成粉的牛肝菌中依次加入內(nèi)標(biāo)和濃度為5～100mmol/l的乙酸銨溶液進(jìn)行提取，得粗提取液；

1.2將步驟1.1所得的混合液流過經(jīng)活化處理后的hicaptmcx固相萃取柱，完成上樣；

1.3用甲醇水溶液進(jìn)行淋洗；

1.4用丙酮、丙酮氨水混合液、丙酮甲酸混合液中的任意一種進(jìn)行洗脫，即得n-亞硝胺的提取液；所述丙酮氨水混合液中丙酮、氨水的體積比為97～99:3～1；丙酮甲酸混合液中丙酮、甲酸的體積比為97～99:3～1；所述氨水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35％；

2.牛肝菌中n-亞硝胺的測(cè)定

將步驟1.4中所得的提取液吹干，再用復(fù)溶溶液進(jìn)行復(fù)溶得待測(cè)液，然后對(duì)待測(cè)液進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定；所述復(fù)溶溶液由甲酸銨溶液和甲酸乙腈溶液配制而成。

上述同位素內(nèi)標(biāo)包括nnn-d4、nnk-d4、nat-d4、nab-d4。

上述同位素內(nèi)標(biāo)的加入量為：每加入1ml乙酸銨溶液對(duì)應(yīng)加入每種同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量均為10ng。

上述步驟1.1中所得粗提取液在上樣前調(diào)ph至3.0～11.0。

上述步驟1.4中丙酮與氨水體積比優(yōu)選為99:1。丙酮與甲酸的體積比優(yōu)選為99:1。

上述洗脫，洗脫液的用量為：每將6ml混合液上樣，淋洗，干燥后使用的洗脫液體積≥0.5ml。優(yōu)選為1～2ml。進(jìn)一步優(yōu)選為1ml。

上述復(fù)溶溶液由0.01mol/l的甲酸銨溶液與甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.1％的甲酸乙腈溶液按照1～2:1～2的體積比配制而成。

上述復(fù)溶溶液的用量為：每使用6ml混合液，復(fù)溶溶液體積≥0.1ml。優(yōu)選為0.1～1ml。進(jìn)一步優(yōu)選為0.2ml。

本發(fā)明基于疏水離子交換固相萃取的牛肝菌中n-亞硝胺的測(cè)定方法中，n-亞硝胺提取液的制備步驟中涉及到的具體參數(shù)及提取條件與牛肝菌中n-亞硝胺的提取方法中相同。

上述步驟2)中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定包括系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制，配制步驟為：

以四種n-亞硝胺的同位素內(nèi)標(biāo)(nnn-d4、nnk-d4、nat-d4和nab-d4)為溶質(zhì)，甲醇為溶劑，配制內(nèi)標(biāo)溶液；以四種n-亞硝胺(nnn、nnk、nat和nab)為溶質(zhì)，甲醇為溶劑，配制系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

本發(fā)明基于疏水離子交換固相萃取的牛肝菌中n-亞硝胺的測(cè)定方法中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作步驟為：

以四種n-亞硝胺的同位素內(nèi)標(biāo)(nnn-d4、nnk-d4、nat-d4和nab-d4)為溶質(zhì)，甲醇為溶劑，配制內(nèi)標(biāo)溶液；以四種n-亞硝胺(nnn、nnk、nat和nab)為溶質(zhì)，甲醇為溶劑，配制系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，將系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，以目標(biāo)分析物峰面積和相應(yīng)同位素峰面積之比對(duì)目標(biāo)分析濃度做回歸分析，即得各目標(biāo)分析物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

上述液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析的條件為：色譜柱：poroshell120ec-c18；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5μl；流動(dòng)相a：0.01mol/l甲酸銨溶液，流動(dòng)相b：0.1％甲酸乙腈溶液；流速：0.4ml/min；流動(dòng)相梯度程序：t＝0min，10％b，t＝2.0min，40％b，t＝4.0min，60％b，t＝6.0min，90％b，t＝9.0min，90％b，t＝9.5min，10％b，t＝15.0min，10％b；質(zhì)譜條件：電噴霧電壓5000v；霧化氣壓力50psi；輔助霧化氣壓力50psi；氣簾氣壓力35psi；離子源溫度450℃；進(jìn)口電壓8v；出口電壓10v；去簇電壓40v；駐留時(shí)間40ms；監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)。

上述多反應(yīng)監(jiān)測(cè)中nnn、nnk、nat和nab的定量離子對(duì)依次為178.1>148.2、208.1>122.1、190.1>160.1和192.1>162.2，相應(yīng)的碰撞電壓依次為15、16、15和17ev；nnn、nnk、nat和nab的定性離子對(duì)依次為178.1>120.1、208.1>106.1、190.1>106.1和192.1>133.1，相應(yīng)的碰撞電壓依次為15、16、15和17ev；nnn-d4、nnk-d4、nat-d4和nab-d4的定量離子對(duì)依次為182.1>152.2、212.1>126.1、194.1>164.1和196.1>166.2，相應(yīng)的碰撞電壓依次為15、16、15和17ev。

上述色譜柱：poroshell120ec-c183.0mm×100mm，2.7μm。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明基于疏水離子交換固相萃取的牛肝菌中n-亞硝胺的提取方法中采用了hicaptmcx固相萃取柱，hicaptmcx固相萃取填料對(duì)樣品提取液具有良好的凈化效果，能有效去除雜質(zhì)及干擾物，提高測(cè)定方法的準(zhǔn)確度和精密度。

本發(fā)明基于疏水離子交換固相萃取的牛肝菌中n-亞硝胺的測(cè)定方法，通過采用hicaptmcx固相萃取柱對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行提取，對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行疏水和陽離子交換，達(dá)到對(duì)目標(biāo)分析物的純化作用，然后用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定性、定量分析牛肝菌中n-亞硝胺，本發(fā)明的測(cè)定方法具有樣品前處理操作簡(jiǎn)單、快捷，雜質(zhì)及干擾物的去除效率高，處理時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液3的色譜圖；

圖2為粗提取液ph值的優(yōu)化結(jié)果圖；

圖3為洗脫液種類的優(yōu)化結(jié)果圖；

圖4為洗脫液體積的優(yōu)化結(jié)果圖；

圖5為淋洗液中甲醇含量的優(yōu)化結(jié)果圖；

圖6為hicaptmcx固相萃取柱中填料質(zhì)量的優(yōu)化結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實(shí)施例1

本實(shí)施例基于疏水離子交換固相萃取的牛肝菌中n-亞硝胺的提取方法，包括以下步驟：

1)分別稱取1.0g凍干研磨成粉的牛肝菌(精確至0.1mg)，置入30ml具塞離心管中，準(zhǔn)確加入30ml濃度10mmol/l的乙酸銨水溶液，置于超聲波發(fā)生器(購自昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：kq-700db)上進(jìn)行超聲處理，超聲提取30min，超聲功率700w，頻率40khz，靜置5min后，置于離心機(jī)上離心5min，離心轉(zhuǎn)速10000rpm，取上層清液，即得粗提取液；粗提取液在上樣前調(diào)ph值至4，作為上樣溶液；

2)準(zhǔn)確稱取500mghicaptmcx固相萃取填料于帶有篩板的固相萃取空柱管中，不斷敲打使填料填充均勻，上端蓋上篩板壓緊，待用；上樣前，依次用1.0ml丙酮、2.0ml甲醇體積分?jǐn)?shù)為5％的甲醇水溶液、2ml水清洗活化固相萃取小柱；之后在重力作用下將6ml步驟1)中所得的上樣溶液自然流過固相萃取小柱以完成上樣過程；

3)上樣結(jié)束后用1ml甲醇體積分?jǐn)?shù)為10％的甲醇水溶液進(jìn)行淋洗，待淋洗完全流過萃取柱后，在真空泵的負(fù)壓作用下抽干淋洗液；

4)最后用2ml丙酮(含1％體積分?jǐn)?shù)的濃氨水)洗脫目標(biāo)分析物，收集，即得。

本實(shí)施例基于疏水離子交換固相萃取的牛肝菌中n-亞硝胺的測(cè)定方法，包括以下步驟：

1.n-亞硝胺提取液的制備

1.1分別稱取1.0g凍干研磨成粉的牛肝菌(精確至0.1mg)，置入30ml具塞離心管中，加入同位素內(nèi)標(biāo)后，準(zhǔn)確加入30ml濃度10mmol/l的乙酸銨水溶液，置于超聲波發(fā)生器(購自昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：kq-700db)上進(jìn)行超聲處理，超聲提取30min，超聲功率700w，頻率40khz，靜置5min后，置于離心機(jī)上離心5min，離心轉(zhuǎn)速10000rpm，取上層清液，即得粗提取液；粗提取液在上樣前的ph值調(diào)至4，作為上樣溶液；

1.2準(zhǔn)確稱取500mghicaptmcx固相萃取填料于帶有篩板的固相萃取空柱管中，不斷敲打使填料填充均勻，上端蓋上篩板壓緊，待用；上樣前，依次用1.0ml丙酮、2.0ml甲醇體積分?jǐn)?shù)為5％的甲醇水溶液、2ml水清洗活化固相萃取小柱。之后在重力作用下將6ml上樣溶液自然流過固相萃取小柱以完成上樣過程；

1.3上樣結(jié)束后用1ml甲醇體積分?jǐn)?shù)為10％的甲醇水溶液進(jìn)行林洗，待淋洗液完全流過萃取柱后，在真空泵的負(fù)壓作用下抽干淋洗液；。

1.4用2ml丙酮(含1％體積分?jǐn)?shù)氨水)洗脫目標(biāo)分析物，收集，即得；

2.n-亞硝胺的測(cè)定

將步驟1.4中所得提取液在35℃下氮?dú)獯蹈?，再?.2ml復(fù)溶溶液進(jìn)行復(fù)溶，得待測(cè)液；復(fù)溶溶液由0.01mol/l的甲酸銨溶液和甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.1％的甲酸乙腈混合溶液按照1:1的體積比配制而成。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：以四種n-亞硝胺的同位素內(nèi)標(biāo)(nnn-d4、nnk-d4、nat-d4和nab-d4)為溶質(zhì)，甲醇為溶劑，配制內(nèi)標(biāo)溶液；以四種n-亞硝胺(nnn、nnk、nat和nab)為溶質(zhì)，甲醇為溶劑，配制系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，具體見下表1，其中內(nèi)標(biāo)的濃度均為10ng/ml。將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

表1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度表

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，分析條件為：色譜柱：poroshell120ec-c18(3.0mm×100mm，2.7μm)；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5μl；流動(dòng)相為0.01mol/l甲酸銨(a)-0.1％甲酸乙腈(b)；流速：0.4ml/min；流動(dòng)相梯度程序：t＝0min,10％b，t＝2.0min,40％b，t＝4.0min,60％b，t＝6.0min,90％b，t＝9.0min,90％b，t＝9.5min,10％b，t＝15.0min,10％b；質(zhì)譜條件：電噴霧電壓5000v；霧化氣(gas1)壓力50psi；輔助霧化氣(gas2)壓力50psi；氣簾氣(gas1)壓力35psi；離子源溫度450℃；進(jìn)口電壓8v；出口電壓10v；去簇電壓40v；駐留時(shí)間40ms；監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)。

所述多反應(yīng)監(jiān)測(cè)中nnn、nnk、nat和nab的定量離子對(duì)依次為178.1>148.2、208.1>122.1、190.1>160.1和192.1>162.2，相應(yīng)的碰撞電壓依次為15、16、15和17ev；nnn、nnk、nat和nab的定性離子對(duì)依次為178.1>120.1、208.1>106.1、190.1>106.1和192.1>133.1，相應(yīng)的碰撞電壓依次為15、16、15和17ev；nnn-d4、nnk-d4、nat-d4和nab-d4的定量離子對(duì)依次為182.1>152.2、212.1>126.1、194.1>164.1和196.1>166.2，相應(yīng)的碰撞電壓依次為15、16、15和17ev。程序運(yùn)行結(jié)束，以目標(biāo)分析物峰面積和相應(yīng)同位素峰面積之比對(duì)目標(biāo)分析物濃度作回歸分析，即得各目標(biāo)分析物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，參數(shù)見下表2，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液3的色譜圖見圖1。

表2各目標(biāo)分析物對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量限和檢測(cè)限

注：檢測(cè)限和定量限是信噪比(s/n)3和10時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度

樣品中n-亞硝胺的測(cè)定：取上述待測(cè)溶液進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，分析條件同上，將測(cè)得的各物質(zhì)峰面積代入下式1中，經(jīng)計(jì)算得到樣品中目標(biāo)分析物的含量。

式1：

式中，m為樣品中目標(biāo)分析物的含量，ng/g；x為目標(biāo)分析物與同位素內(nèi)標(biāo)的峰面積之比；a為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，b為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；v為樣品提取液的體積，ml；n為樣品質(zhì)量，g。

實(shí)施例2

按實(shí)施例1所述的測(cè)定方法，選取另外幾種牛肝菌，測(cè)定其中n-亞硝胺的含量，沒有測(cè)到相應(yīng)的n-亞硝胺。

本發(fā)明中的其他實(shí)施例中，粗提取液的ph可以調(diào)至3.4-11.0，進(jìn)一步的本發(fā)明中的其他實(shí)施例中粗提取液的ph可以選擇為3.4、6、10.5或11，其它同實(shí)施例1。由于固相萃取柱中填料對(duì)目標(biāo)分析物的萃取主要是靠疏水和陽離子交換作用，ph在4.0-6.0時(shí)大部分目標(biāo)分析物分子以質(zhì)子化形式存在，而填料中的陽離子交換基團(tuán)以負(fù)離子形式存在，此時(shí)填料和目標(biāo)分析物之間的疏水作用和陽離子交換作用力較強(qiáng)，因此具有最佳的萃取效果。如圖2所示，在所考察的ph值范圍(3.4-11.0)內(nèi)，在ph為4.0時(shí)，所有被分析物具有較好的萃取效果。

本發(fā)明中的其他實(shí)施例中，步驟4)及1.4中洗脫液可選用丙酮、丙酮氨水混合液、丙酮甲酸混合液中的任意一種。進(jìn)一步的，還可以為含3％體積分?jǐn)?shù)氨水的丙酮混合液、含1％或3％體積分?jǐn)?shù)甲酸的丙酮混合液或丙酮，其它同實(shí)施例1。如圖3洗脫液種類、圖4洗脫液體積優(yōu)化結(jié)果圖所示，在丙酮中添加一定比例的氨水，能夠提高目標(biāo)分析物的解吸效率，這是因?yàn)閴A性條件下能夠破壞填料和目標(biāo)分析物之間的陽離子交換作用。

本發(fā)明中的其他實(shí)施例中，步驟3)及1.3中淋洗液中甲醇含量可以為5～20％。進(jìn)一步地，甲醇水溶液中甲醇的體積分?jǐn)?shù)還可以為5％、8％、10％、12％、15％或20％，其它同實(shí)施例1。如圖5淋洗液中甲醇含量的優(yōu)化結(jié)果圖所示，當(dāng)甲醇含量為10％時(shí)，目標(biāo)分析物具有較好的萃取效率。

本發(fā)明中的其他實(shí)施例中，hicaptmcx固相萃取填料的質(zhì)量可以在50-1000mg范圍內(nèi)。進(jìn)一步地，hicaptmcx固相萃取填料的用量還可以為50mg、100mg、200mg、300mg或1000mg，其它同實(shí)施例1。如圖6所示，填料的質(zhì)量在50-1000mg范圍內(nèi)，隨著填料質(zhì)量不斷提高，目標(biāo)分析物的峰面積均顯著提高，當(dāng)填料的質(zhì)量達(dá)到500mg時(shí)，繼續(xù)增加填料質(zhì)量，目標(biāo)分析物的峰面積提高不明顯，綜合考慮所有目標(biāo)分析物的萃取效果，優(yōu)選填料的質(zhì)量為500mg。

在本發(fā)明其它的實(shí)施例中，乙酸銨溶液的濃度還可以為5mmol/l、15mmol/l、50mmol/l、80mmol/l或100mmol/l，其它同實(shí)施例1。

在本發(fā)明其它的實(shí)施例中，超聲提取、漩渦振蕩的條件均可適當(dāng)調(diào)整。

試驗(yàn)例

精密度及加標(biāo)回收測(cè)試

為考察上述測(cè)定方法的抗干擾性，在實(shí)施例1加入乙酸銨溶液前的樣品中加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成低、中、高三種濃度的樣品(低、中、高濃度對(duì)應(yīng)的值分別為各目標(biāo)分析物線性范圍最低值的2、10和40倍)。在優(yōu)化的分析條件下，目標(biāo)分析物與干擾物分離良好，干擾物不影響目標(biāo)分析物的定量。

以一天內(nèi)配制的5個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算不同濃度下的日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；以連續(xù)3天配制的樣品進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算不同濃度下的日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；將分析所得的峰面積之比代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算得到待測(cè)溶液中目標(biāo)分析物的含量，并與實(shí)際添加量相比得到相對(duì)回收率，結(jié)果見下表3。從表3可以看出，目標(biāo)分析物在不同濃度下的日內(nèi)及日間精密度分別小于4.6％和4.2％，說明該方法具有較好的重現(xiàn)性。同時(shí)，不同濃度下目標(biāo)分析物的相對(duì)回收率介于92.2％～108.9％之間。

表3精密度及加標(biāo)回收測(cè)試結(jié)果