本發(fā)明涉及一種基于硼酸-二醇特異性識(shí)別作用的層層組裝薄膜的制備方法。

背景技術(shù)：

氧化還原蛋白質(zhì)或酶在基底上的固定是不依賴于媒介體的電化學(xué)生物傳感器、生物反應(yīng)器以及其它生物裝置的重要前提，并引起了研究者的廣泛關(guān)注。在固體表面固定酶或蛋白質(zhì)并有效實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)直接電化學(xué)的方法之一是將其固定在修飾于電極表面的薄膜中。在各種制備薄膜的方法中，層層組裝(layer-by-layer,lbl)技術(shù)表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢(shì)，它能夠根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)的方案在納米或分子層次上控制薄膜的組成與厚度，并且組裝程序非常簡(jiǎn)便。lbl組裝的成膜驅(qū)動(dòng)力逐漸由靜電作用力擴(kuò)展到各種各樣的非靜電相互作用如離子-偶極作用力、氫鍵作用和特異性相互作用等。在各種特異性相互作用中，硼酸基團(tuán)和二醇單元之間的相互作用在構(gòu)筑薄膜方面引起了許多研究者的興趣。苯硼酸(phenylboronicacid,pba)及其衍生物能夠與各種1,2-或1,3-順二醇化合物(如多元醇、糖類化合物)生成硼酸-二醇間的共價(jià)鍵，并形成五元或六元環(huán)狀的硼酯復(fù)合物。如聚乙烯醇或甘露糖可以與含有pba基團(tuán)的聚電解質(zhì)構(gòu)筑lbl薄膜。一個(gè)單糖分子通常含有5個(gè)-oh基團(tuán)，而一個(gè)pba基團(tuán)可以與兩個(gè)-oh基團(tuán)結(jié)合，因此它們可以形成1:2的糖-pba復(fù)合物。葡聚糖(dextran,dex)是以葡萄糖為單體的聚多糖，其分子骨架上含有許多可以與pba基團(tuán)結(jié)合的葡萄糖單元。雖然dex和pba之間的特異性親和作用已有報(bào)道，但是由dex與含有pba基團(tuán)的聚電解質(zhì)構(gòu)筑的蛋白質(zhì)層層組裝薄膜至今未見報(bào)道。

目前吸入型蛋白質(zhì)lbl薄膜已經(jīng)發(fā)展成為一種新型的蛋白質(zhì)lbl薄膜：將固體基底表面組裝的聚合物和/或納米粒子lbl薄膜浸泡在蛋白質(zhì)溶液中，使蛋白質(zhì)自發(fā)吸入薄膜，形成吸入型蛋白質(zhì)lbl薄膜。與通常的直接將蛋白質(zhì)和其他組分構(gòu)筑的蛋白質(zhì)lbl薄膜相比，吸入型蛋白質(zhì)lbl薄膜中的蛋白質(zhì)是自發(fā)地?cái)U(kuò)散進(jìn)入薄膜內(nèi)部，并且獨(dú)立于lbl薄膜的組裝過程，因此該方法在保持蛋白質(zhì)的原有結(jié)構(gòu)和生物活性方面表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。在電極上構(gòu)筑不同類型的吸入型蛋白質(zhì)lbl薄膜的研究已有報(bào)道，并實(shí)現(xiàn)了氧化還原蛋白質(zhì)在該類型薄膜電極上的直接電化學(xué)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種合成了既含有苯硼酸pba基團(tuán)又含有羧酸基團(tuán)的聚電解質(zhì)paa-pba的基于硼酸-二醇特異性識(shí)別作用的層層組裝薄膜的制備方法。

本發(fā)明基于硼酸-二醇特異性識(shí)別作用的層層組裝薄膜的制備方法，包括：

通過氨基苯硼酸與聚丙烯酸paa的羧基之間的縮合反應(yīng)將苯硼酸pba基團(tuán)接枝到聚丙烯酸paa骨架上，得到產(chǎn)物聚丙烯酸-苯硼酸paa-pba；然后利用聚丙烯酸-苯硼酸paa-pba與葡聚糖dex之間的硼酸-二醇特異性識(shí)別作用在熱解石墨pg電極表面上組裝{paa-pba/dex}nlbl薄膜，然后再?gòu)娜芤褐形爰〖t蛋白mb，形成{paa-pba/dex}n-mb薄膜。

進(jìn)一步地，聚丙烯酸-苯硼酸paa-pba的合成包括：

聚丙烯酸-苯硼酸paa-pba聚電解質(zhì)是由聚丙烯酸paa與3-氨基苯硼酸半硫酸鹽apba在交聯(lián)劑n-羥基丁二胺磺酸鈉nhs和n-(3-二甲氨基丙基)-n′-乙基-碳二亞胺鹽酸鹽edc存在的條件下發(fā)生縮合反應(yīng)，將pba接枝到paa骨架上而合成的，其合成路線如下式所示：

進(jìn)一步地，聚丙烯酸-苯硼酸paa-pba的合成具體包括：

將0.57g的聚丙烯酸paa水溶液，聚丙烯酸paa水溶液含有2.77mmol單體用20ml,50mm的4-羥乙基哌嗪乙磺酸hepes緩沖溶液稀釋，將溶液ph調(diào)至8.5；將20ml,61mm的3-氨基苯硼酸半硫酸鹽apba同樣溶于ph8.5的20ml,50mm的4-羥乙基哌嗪乙磺酸hepes緩沖溶液中；然后將上述兩種溶液混合；逐滴加入含有4ml,31mm的n-羥基丁二胺磺酸鈉nhs的50mm,ph8.5的4-羥乙基哌嗪乙磺酸hepes緩沖溶液，并攪拌10min；將含有4ml,310mm的n-(3-二甲氨基丙基)-n′-乙基-碳二亞胺鹽酸鹽edc的50mm,ph8.5的4-羥乙基哌嗪乙磺酸hepes溶液加入上述反應(yīng)混合溶液中，室溫下攪拌12h；然后將上述溶液透析一周以除去所有小分子量的雜質(zhì)，冷凍干燥后得到產(chǎn)物聚丙烯酸-苯硼酸paa-pba，為白色粉末狀固體。

進(jìn)一步地，{paa-pba/dex}n-mb薄膜的組裝包括：

熱解石墨pg電極的制作：用熱縮管將直徑為4.5mm，長(zhǎng)6mm左右的圓柱型熱解石墨密封在直徑與之相等的不銹鋼圓柱棒一端，使熱解石墨pg的一側(cè)表面緊貼在不銹鋼棒一端的表面，從而形成導(dǎo)電通路，而熱解石墨pg的另一側(cè)表面作為電極表面；將電極表面在320目的金相砂紙上打磨后，再在蒸餾水中超聲30s，洗凈吹干，即可作為工作電極；電極表面的幾何面積為0.16cm²；

將處理好的pg電極首先浸入帶有正電荷的1mgml^–1,ph5.0殼聚糖cs溶液中15min，使之在熱解石墨pg表面吸附一層殼聚糖cs前驅(qū)膜；然后將pg/cs電極交替浸入帶有負(fù)電荷的1mgml^–1,ph9.0的paa-pba和中性1mgml^–1,ph9.0的dex水溶液中各15min，溶液轉(zhuǎn)換時(shí)用水清洗并吹干，在電極表面形成一個(gè)paa-pba/dex雙層；重復(fù)上述過程直到在pg/cs表面上形成所需雙層數(shù)的{paa-pba/dex}nlbl薄膜；將組裝好的上述薄膜電極浸入1mgml^–1的mb溶液，中預(yù)定時(shí)間，以確保mb分子擴(kuò)散進(jìn)入到薄膜內(nèi)部，然后取出洗滌并吹干，表示為{paa-pba/dex}n-mb；mb溶液為ph5.0，含0.2mnacl。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明基于硼酸-二醇特異性識(shí)別作用的層層組裝薄膜的制備方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明合成了既含有苯硼酸(pba)基團(tuán)又含有羧酸基團(tuán)的聚電解質(zhì)paa-pba(paa：聚丙烯酸)。采用層層組裝(lbl)技術(shù)，利用paa-pba和葡聚糖(dex)之間的硼酸-二醇特異性識(shí)別作用，在熱解石墨電極(pg)表面構(gòu)筑了{(lán)paa-pba/dex}nlbl薄膜，再?gòu)娜芤褐形爰〖t蛋白(mb)，形成{paa-pba}n-mb薄膜；采用循環(huán)伏安方法研究了{(lán)paa-pba/dex}n薄膜中mb的直接電化學(xué)及其對(duì)氧氣和過氧化氫的電催化還原。結(jié)果表明該薄膜為保持mb的生物活性提供了良好的微環(huán)境，為蛋白質(zhì)的固定提供了一種新型的lbl薄膜，為設(shè)計(jì)基于酶的直接電化學(xué)的生物傳感器提供了一個(gè)新的思路。

上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說明如后。

附圖說明

圖1是在mb溶液中浸泡9h后的{paa-pba/dex}n-mb薄膜表現(xiàn)出不同的γ*值；

圖2是用sem對(duì)組裝在pg/cs表面的{paa-pba/dex}6層層組裝薄膜的表面形貌圖；

圖3是用sem對(duì)組裝在pg/cs表面的{paa-pba/dex}6/paa-pba層層組裝薄膜的表面形貌圖；

圖4是用sem對(duì)組裝在pg/cs表面的{paa-pba/dex}6-mb層層組裝薄膜的表面形貌圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

如圖1所示，本發(fā)明一種基于硼酸-二醇特異性識(shí)別作用的層層組裝薄膜的制備方法的最佳實(shí)施例，包括：

通過氨基苯硼酸與聚丙烯酸paa的羧基之間的縮合反應(yīng)將苯硼酸pba基團(tuán)接枝到聚丙烯酸paa骨架上，得到產(chǎn)物聚丙烯酸-苯硼酸paa-pba；然后利用聚丙烯酸-苯硼酸paa-pba與葡聚糖dex之間的硼酸-二醇特異性識(shí)別作用在熱解石墨pg電極表面上組裝{paa-pba/dex}nlbl薄膜，然后再?gòu)娜芤褐形爰〖t蛋白mb，形成{paa-pba/dex}n-mb薄膜。

進(jìn)一步地，聚丙烯酸-苯硼酸paa-pba的合成包括：

聚丙烯酸-苯硼酸paa-pba聚電解質(zhì)是由聚丙烯酸paa與3-氨基苯硼酸半硫酸鹽apba在交聯(lián)劑n-羥基丁二胺磺酸鈉nhs和n-(3-二甲氨基丙基)-n′-乙基-碳二亞胺鹽酸鹽edc存在的條件下發(fā)生縮合反應(yīng)，將pba接枝到paa骨架上而合成的，其合成路線如下式所示：

paa-pba的合成，其過程為，將0.57g的paa水溶液(含有2.77mmol單體)用hepes緩沖溶液(20ml,50mm)稀釋，將溶液ph調(diào)至8.5；將apba(20ml,61mm)同樣溶于ph8.5的hepes緩沖溶液(20ml,50mm)中；然后將上述兩種溶液混合。逐滴加入含有nhs(4ml,31mm)的hepes緩沖溶液(50mm,ph8.5)，并攪拌10min。將含有edc(4ml,310mm)的hepes溶液(50mm,ph8.5)加入上述反應(yīng)混合溶液中，室溫下攪拌12h。然后將上述溶液透析一周以除去所有小分子量的雜質(zhì)，冷凍干燥后得到產(chǎn)物paa-pba，為白色粉末狀固體。

{paa-pba/dex}n-mb薄膜的組裝：

pg電極的制作：用熱縮管將直徑為4.5mm，長(zhǎng)6mm左右的圓柱型basalplane熱解石墨密封在直徑與之相等的不銹鋼圓柱棒一端。使pg的一側(cè)表面緊貼在不銹鋼棒一端的表面，從而形成導(dǎo)電通路，而pg的另一側(cè)表面作為電極表面。將電極表面在320目的金相砂紙上打磨后，再在蒸餾水中超聲30s，洗凈吹干，即可作為實(shí)驗(yàn)中使用的工作電極。電極表面的幾何面積為0.16cm²。

將處理好的pg電極首先浸入帶有正電荷的cs溶液(1mgml^–1,ph5.0)中15min，使之在pg表面吸附一層cs前驅(qū)膜。然后將pg/cs電極交替浸入帶有負(fù)電荷的paa-pba(1mgml^–1,ph9.0)和中性dex(1mgml^–1,ph9.0)水溶液中各15min，溶液轉(zhuǎn)換時(shí)用水清洗并吹干，可在電極表面形成一個(gè)paa-pba/dex雙層。重復(fù)上述過程直到在pg/cs表面上形成所需雙層數(shù)(n)的{paa-pba/dex}nlbl薄膜。將組裝好的上述薄膜電極浸入1mgml^–1的mb溶液(ph5.0，含0.2mnacl)中一定時(shí)間，以確保mb分子擴(kuò)散進(jìn)入到薄膜內(nèi)部，然后取出洗滌并吹干，表示為{paa-pba/dex}n-mb。然后將固載了mb的薄膜轉(zhuǎn)移到ph7.0的空白緩沖溶液中進(jìn)行電化學(xué)研究。

采用循環(huán)伏安方法研究了{(lán)paa-pba/dex}n薄膜中mb的直接電化學(xué)及其對(duì)氧氣和過氧化氫的電催化還原。

馬骨骼或肌肉肌紅蛋白(mb,mw≈17800)，3-氨基苯硼酸半硫酸鹽(apba)，聚丙烯酸(paa,mw≈100000,35wt.％水溶液)，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(hepes,99.5％)，n-(3-二甲氨基丙基)-n′-乙基-碳二亞胺鹽酸鹽(edc)，n-羥基丁二胺磺酸鈉(nhs)，葡聚糖(dex,mw～200000)和殼聚糖(cs，酰胺化程度大于85％，mw≈200000)，醋酸鈉(分析純)，磷酸二氫鈉(分析純)均購(gòu)自sigma-aldrich。k3fe(cn)6，k4fe(cn)6和過氧化氫(h2o2,30％)購(gòu)自北京化工廠。緩沖溶液為0.1m醋酸鈉溶液(ph4.0-6.0)，0.05m的磷酸二氫鈉溶液(ph7.0-8.5)和0.05m的硼酸溶液(ph9.0)，用稀hcl或koh溶液調(diào)節(jié)到所需ph值，緩沖溶液中均含有0.1mnacl。所有溶液均用經(jīng)過離子交換和蒸餾純化的三次蒸餾水配制。實(shí)驗(yàn)用水均為經(jīng)過離子交換和蒸餾純化的三次水。

電化學(xué)測(cè)量采用chi660a型電化學(xué)工作站(美國(guó)chi儀器公司)，使用典型的三電極體系，參比電極：飽和甘汞電極(sce)，輔助電極：鉑電極，工作電極：修飾有l(wèi)bl薄膜的熱解石墨(pyrolyticgraphite，簡(jiǎn)稱pg，來自advancedceramics)電極。電解池中的緩沖溶液為不含蛋白質(zhì)的空白緩沖溶液。在電化學(xué)測(cè)量前，向緩沖溶液中通入高純氮10min以除去溶液中的氧氣，并在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中始終保持氮?dú)夥諊?o2催化實(shí)驗(yàn)除外)。電化學(xué)阻抗譜(eis)實(shí)驗(yàn)以等濃度的fe(cn)6³-和fe(cn)6⁴-溶液(5mm，含0.1mnacl)作為電活性探針，在其式量電位0.17v(vssce)上施加小振幅的正弦交流電壓，振幅為±5mv，頻率范圍為0.1-10⁵hz。掃描電子顯微鏡(sem)實(shí)驗(yàn)采用s-4800冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(hitachi)，加速電壓為3kv。組裝在pg電極上的lbl薄膜作為測(cè)試樣品。在sem實(shí)驗(yàn)之前，采用e-1045離子濺射儀(hitachi)在樣品表面鍍一層鉑膜。所有的實(shí)驗(yàn)均在室溫(20±2℃)下進(jìn)行。

{paa-pba/dex}nlbl薄膜的層層組裝：

打磨后的planepg電極暴露出一些edge面，因此既具有疏水性也具有一定親水性。由于edge面的碳被氧化后連接有o^-，oh^-等基團(tuán)，因此表面帶一定負(fù)電荷。cs在ph5.0時(shí)因pka≈6.5[i]而帶有正電荷，因此可以作為前驅(qū)膜吸附在pg電極表面。paa-pba的分子骨架中含有大量的自由的-cooh基團(tuán)，paa在水溶液中的pka約為6.0，因此在ph9.0時(shí)paa-pba中自由的羧基被離子化而帶負(fù)電荷，這樣帶負(fù)電荷的paa-pba可以被靜電吸附到帶有相反電荷的pg/cs膜表面。因此pg電極與cs之間、cs與paa-pba之間的組裝驅(qū)動(dòng)力主要是靜電相互作用力。但是后續(xù)組裝的dex是一種不帶電荷中性聚多糖，因此dex在paa-pba表面的吸附以及后續(xù){paa-pba/dex}n多層膜組裝的主要通過硼酸-二醇特異性識(shí)別作用相結(jié)合。

本發(fā)明采用循環(huán)伏安(cv)法，以k3fe(cn)6為電活性探針監(jiān)測(cè){paa-pba/dex}n薄膜在pg電極表面的組裝。在裸的pg或pg/cs薄膜電極上，k3fe(cn)6在ph7.0的溶液中于0.17v附近表現(xiàn)出一對(duì)良好的、近乎可逆的cv還原氧化峰。而當(dāng){paa-pba/dex}nlbl薄膜組裝到pg/cs表面時(shí)，探針的cv峰電流顯著下降，這是因?yàn)樵陔姌O表面形成的薄膜屏障阻礙了探針到達(dá)底層的電極表面并進(jìn)行電子交換。隨著薄膜雙層膜數(shù)n的增加，k3fe(cn)6的電流逐漸降低，由此表明在pg電極表面成功構(gòu)筑了{(lán)paa-pba/dex}n多層薄膜。

{paa-pba/dex}n薄膜對(duì)mb的吸入：

在合適的條件下，mb能夠從其水溶液中自發(fā)地被吸入到{paa-pba/dex}n薄膜之中，形成{paa-pba/dex}n-mb薄膜。首先采用電化學(xué)阻抗譜(eis)法以fe(cn)6^3-/4-為電活性探針證實(shí)mb被吸入和固定于{paa-pba/dex}6薄膜中。對(duì)于裸的pg電極和pg/cs薄膜，fe(cn)6^3–/4–的eis響應(yīng)在ph7.0溶液中都表現(xiàn)為一條warburg直線，這是受擴(kuò)散控制的電化學(xué)過程的特征。當(dāng){paa-pba/dex}6薄膜在mb溶液中的浸泡9h后，在高頻區(qū)可以觀察到一個(gè)明顯的半圓形響應(yīng)(曲線d)，其eis響應(yīng)的半圓直徑遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于吸入mb之前的{paa-pba/dex}6薄膜的半圓直徑(曲線c)。半圓的直徑通常等于探針的電荷轉(zhuǎn)移電阻。對(duì)于薄膜體系，電荷轉(zhuǎn)移電阻主要反映了探針在薄膜中擴(kuò)散的難易程度，與薄膜的通透性直接相。由此說明吸入{paa-pba/dex}6薄膜中的mb作為物理屏障進(jìn)一步阻礙和限制了探針到達(dá)電極表面，從而反過來證實(shí)了mb在薄膜中的吸入。

在這里，mb的等電點(diǎn)為6.8，其表面凈電荷在ph5.0時(shí)為正。而{paa-pba/dex}6薄膜是由帶負(fù)電荷的paa-pba和不帶電荷的dex兩種成膜材料組成，因此{(lán)paa-pba/dex}6薄膜帶負(fù)電荷。在ph5.0條件下，帶負(fù)電荷的薄膜將吸引帶正電荷的mb。因此，mb和{paa-pba/dex}6薄膜中paa-pba組分之間的靜電吸引力也是促使薄膜吸入mb的另一重要驅(qū)動(dòng)力。

由于薄膜中的mb具有電活性，可以作為指示劑，因此其吸入過程也可以通過cv響應(yīng)來監(jiān)測(cè)。例如，將組裝了{(lán)paa-pba}6薄膜的pg電極浸入mb溶液中一定時(shí)間，水洗吹干，然后轉(zhuǎn)移到ph7.0的空白緩沖溶液中，在+0.1v至-0.8v的電位范圍進(jìn)行cv掃描，在-0.34v(vssce)處可以觀察到一對(duì)可逆性良好的還原氧化峰，這是mb中血紅素fe(iii)/fe(ii)電對(duì)的特征峰。平行實(shí)驗(yàn)中的6組{paa-pba}6-mb薄膜電極的平均式量電位為-0.34v，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.011v，表明薄膜的重現(xiàn)性非常好。而不含mb的{paa-pba}6薄膜在此電位范圍內(nèi)沒有任何cv響應(yīng)。mb的cv還原峰電流(ipc)隨著{paa-pba}6多層膜在mb溶液中浸泡時(shí)間的增長(zhǎng)而增加，在大約9h后達(dá)到穩(wěn)態(tài)。因此，在以后的實(shí)驗(yàn)中，我們均采用9h作為在mb溶液中的浸泡時(shí)間。{paa-pba}6-mb薄膜的cv陰極峰和陽極峰的峰高和峰面積幾乎相等，且在0.05–2.0vs^-1的范圍內(nèi)峰電流與掃速呈線性關(guān)系，表明該薄膜中的mb的伏安行為具有典型的非擴(kuò)散控制的薄層電化學(xué)的特征。在此條件下，對(duì){paa-pba}6-mb薄膜的cv陰極峰進(jìn)行積分，可得到薄膜中全部電活性的mb發(fā)生還原反應(yīng)時(shí)的電量q，根據(jù)法拉第定律q＝nafγ*，可以將q進(jìn)一步換算為電活性mb在薄膜電極上的表面濃度(г*,molcm^-2)^[32]。其中n是電子轉(zhuǎn)移數(shù)(1)，a是pg電極表面的幾何面積(0.16cm²)，f為法拉第常數(shù)(96487cmol^-1)。如果采用γ*9h表示在mb溶液浸泡9h后薄膜中電活性mb的表面濃度，則6組平行實(shí)驗(yàn)的{paa-pba}6-mb薄膜的平均γ*9h約為1.25×10^-10molcm^-2。

雙層數(shù)對(duì)吸入mb量的影響：對(duì)于雙層數(shù)n不同的{paa-pba/dex}n-mb薄膜，mb在薄膜電極上的表面濃度γ*與浸泡時(shí)間的關(guān)系表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，即γ*隨著時(shí)間的增加而增大，在大約9h后趨于穩(wěn)態(tài)。但是當(dāng)雙層數(shù)不同時(shí)，在mb溶液中浸泡9h后的{paa-pba/dex}n-mb薄膜表現(xiàn)出不同的γ*值(圖1)，γ*值隨著雙層數(shù)n的增加而增加，當(dāng)n＝6時(shí)，γ*值達(dá)到最大值，繼而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此在以后的實(shí)驗(yàn)中我們選擇雙層數(shù)為6的{paa-pba}6-mb薄膜作為主要研究對(duì)象。這是因?yàn)殡S著薄膜雙層數(shù)n從1到6的不斷增加，{paa-pba/dex}n薄膜變得越來越厚，這樣可以吸納更多的mb分子，因而傾向于獲得更大的γ*值；但是同時(shí)薄膜的通透性會(huì)隨著薄膜厚度的增加而降低，因此溶液中小分子量的對(duì)離子進(jìn)出薄膜變得越來越困難，導(dǎo)致mb分子之間的電子自交換更加困難，故γ*值呈減小的趨勢(shì)。這兩種效果相反的因素共同作用，使得γ*值在n＝6時(shí)達(dá)到最大值。

{paa-pba}6-mb薄膜具有良好的穩(wěn)定性。將{paa-pba}6-mb薄膜置于空白緩沖溶液中，在所研究的電位范圍內(nèi)進(jìn)行cv掃描200圈后，cv峰的位置仍然保持不變，峰高只下降了約1.5％。將{paa-pba}6-mb薄膜置于空白緩沖溶液中浸泡一周后，其峰電流值仍能夠保持其起始峰高的80％。

表面形態(tài)特征：

用sem對(duì)組裝在pg/cs表面的{paa-pba/dex}6，{paa-pba/dex}6/paa-pba和{paa-pba/dex}6-mb層層組裝薄膜的表面形貌進(jìn)行了表征(圖2、3、4)。從圖中可以看出，在相同的放大倍率下，{paa-pba/dex}6薄膜和{paa-pba/dex}6/paa-pba薄膜的表面形貌比較平整，并能觀察到一些孔洞或通道，沒有表現(xiàn)出明顯的差異，表明組裝過程中相鄰的paa-pba與dex層有一定程度的相互交錯(cuò)或者滲透。而{paa-pba/dex}6-mb薄膜顯示出相對(duì)粗糙的表面，說明溶液中的mb分子不但被“吸入”到薄膜的內(nèi)部，而且吸附在{paa-pba/dex}6薄膜的表面。在這里，需要說明的是被“吸入”到薄膜的內(nèi)部的mb對(duì){paa-pba/dex}6-mb直接電化學(xué)響應(yīng)做出了主要貢獻(xiàn)，這是因?yàn)槿芤褐械膍b在薄膜表面的吸附過程一般不到30min即可達(dá)到穩(wěn)態(tài)^[ii]，而本實(shí)驗(yàn)中mb在{paa-pba/dex}6薄膜中的固載達(dá)到穩(wěn)態(tài)所需要的時(shí)間大約需要9h，表明蛋白質(zhì)進(jìn)入薄膜是一個(gè)相對(duì)緩慢的過程。

測(cè)試底液中ph和支持電解質(zhì)的影響：

測(cè)試底液的ph對(duì){paa-pba/dex}6-mb薄膜的cv響應(yīng)也有很重要的影響。將已經(jīng)吸入mb達(dá)穩(wěn)態(tài)的{paa-pba/dex}6-mb薄膜電極置于含有0.1m的nacl而不同ph的測(cè)試底液中進(jìn)行cv掃描，mb的cv峰位置表現(xiàn)出明顯的移動(dòng)。若定義cv氧化峰和還原峰的峰電位的平均值作為體系的式量電位(e°′)，e°′隨著底液的ph的增加而負(fù)移。在ph4.0到9.0范圍內(nèi)，e°′與測(cè)試底液的ph成線性關(guān)系，斜率為-53.3mvph^-1。該值近似于具有相同質(zhì)子與電子轉(zhuǎn)移數(shù)的伴隨著有質(zhì)子轉(zhuǎn)移的可逆電極反應(yīng)的理論值-58mvph^-1(20℃)。由此說明該薄膜電極上mb的血紅素輔基在發(fā)生單電子傳遞的同時(shí)，很可能伴隨著一個(gè)質(zhì)子的轉(zhuǎn)移：mbfe(iii)+h⁺+e^-＝mbfe(ii)。

根據(jù)電子跳躍機(jī)理，{paa-pba/dex}6-mb薄膜中mb分子與電極之間發(fā)生電子交換時(shí)為了補(bǔ)償電子轉(zhuǎn)移過程中造成的薄膜內(nèi)的電荷改變，即維持薄膜相的電中性，溶液相中的對(duì)離子必須能夠進(jìn)入或離開薄膜相以補(bǔ)償由于電子轉(zhuǎn)移造成的薄膜內(nèi)部電荷的不均衡。例如，當(dāng)薄膜內(nèi)mbfe(iii)發(fā)生還原時(shí)，薄膜內(nèi)會(huì)產(chǎn)生多余的負(fù)電荷，因此需要薄膜相中的陰離子轉(zhuǎn)移到溶液相，或者溶液相中的陽離子轉(zhuǎn)移到薄膜相，以補(bǔ)償由于電子轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生的多余負(fù)電荷。因此我們選用相同濃度的不同支持電解質(zhì)作為測(cè)試底液來對(duì)薄膜進(jìn)行cv測(cè)試，考察了不同類型支持電解質(zhì)對(duì){paa-pba/dex}6-mb薄膜電化學(xué)行為的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：不同的支持電解質(zhì)對(duì){paa-pba/dex}6-mb薄膜的cv峰形的影響很小，它們峰高和峰電位基本一致。

{paa-pba/dex}6-mb薄膜的電催化性質(zhì)：

用循環(huán)伏安法法研究了{(lán)paa-pba}6-mb薄膜電極對(duì)氧氣和過氧化氫等底物的電化學(xué)催化還原行為。當(dāng)用注射器向經(jīng)過除氧的ph7.0緩沖溶液中注入一定量的空氣后，與通入氧氣之前相比，可以觀察到{paa-pba}6-mb薄膜電極在大約-0.4v左右的cv還原峰電流隨著空氣通入量的增加而顯著增加，并且伴隨著mbfe(ii)氧化峰的消失，這是由于mbfe(ii)已經(jīng)與溶液中的氧發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)。而對(duì)于不含mb的{paa-pba}6薄膜電極，氧氣直接還原的峰電位大約在-0.9v左右。因此，{paa-pba}6-mb薄膜中的mb使氧的還原過電位降低了大約0.5v。結(jié)果證明了薄膜中的mb可以有效地電催化還原o2。

{paa-pba}6-mb薄膜電極也可以用來電催化還原h(huán)2o2。將h2o2注入ph7.0的緩沖溶液中，cv結(jié)果顯示：{paa-pba}6-mb薄膜電極中mb的cv氧化峰降低而還原峰顯著增大，并隨著溶液中h2o2濃度的增大，還原峰電流值逐漸增高，線性范圍2.0-85μm。然而對(duì)于不含mb的{paa-pba}6薄膜，在掃描電位0.1至-1.2v的電位范圍內(nèi)則沒有觀察到h2o2的直接電化學(xué)還原信號(hào)。

本發(fā)明首先合成了既含有pba基團(tuán)又含有羧酸基團(tuán)的聚電解質(zhì)paa-pba，然后將paa-pba作為成膜材料，利用paa-pba和dex二者之間的硼酸-二醇特異性識(shí)別作用，采用層層組裝(lbl)技術(shù)，在電極表面上成功構(gòu)筑了{(lán)paa-pba}nlbl薄膜。生物大分子mb可以自發(fā)地從ph5.0的緩沖溶液中進(jìn)入該多層薄膜中，形成穩(wěn)定的{paa-pba/dex}n-mblbl薄膜。{paa-pba}n薄膜為保持mb的生物活性提供了適宜的微環(huán)境，并成功實(shí)現(xiàn)了mb在薄膜中的直接電化學(xué)及其對(duì)氧和過氧化氫的電催化還原。采用各種方法表征了{(lán)paa-pba}n多層膜的組裝及{paa-pba}n-mb薄膜的性質(zhì)，如循環(huán)伏安法(cv)、電化學(xué)阻抗法(eis)和掃描電子顯微鏡(sem)等。本發(fā)明利用硼酸-二醇特異性識(shí)別作用構(gòu)筑的{paa-pba/dex}n-mb吸入型蛋白質(zhì)層層組裝薄膜是一種新類型的蛋白質(zhì)lbl薄膜，可作為不依賴于媒介體的電化學(xué)生物傳感器的基礎(chǔ)，為設(shè)計(jì)基于酶的直接電化學(xué)的生物傳感器提供了一個(gè)新的思路。另外，本發(fā)明對(duì)該模型體系中{paa-pba/dex}n多層膜的組裝及mb吸入過程中的各種相互作用力的探討也可以有助于發(fā)展新型的基于蛋白質(zhì)直接電化學(xué)的生物傳感器和生物反應(yīng)器。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。