本發(fā)明涉及生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及檢測二價汞離子的生物傳感器。

背景技術(shù)：

作為全球性環(huán)境污染物，汞具有致畸、致癌作用，是蓄積性毒物，有生物不可降解性，其人為釋放及其對生態(tài)系統(tǒng)功能和人類健康的影響受到國際社會的普遍關(guān)注。汞污染大多數(shù)來源于固體廢物焚燒和化石燃料的燃燒，能在大氣中長期穩(wěn)定存在，從而嚴重污染了一些水源和土壤。而且，無機汞能在海洋環(huán)境中的一些微生物作用下轉(zhuǎn)化為毒性更大的甲基汞，并在食物鏈的各個環(huán)節(jié)中積累，最終通過食物鏈進入人體，會沉積在腦、肝和其它器官中，產(chǎn)生慢性中毒，損害腎、腦、胃和腸道,甚至引起死亡。汞是一種劇毒的全球性環(huán)境污染物，嚴重危害環(huán)境和人類健康。因此，對環(huán)境、食品中痕量汞的檢測十分重要，簡單快速、高靈敏、高選擇性的檢測汞的方法備受關(guān)注。

目前測定汞常用方法主要有冷原子吸收法、冷原子熒光法、色譜法和等離子體電感耦合質(zhì)譜法，雖然這些方法的準確度較高，但往往需要大型的儀器設(shè)備，且成本比較高，處理過程繁瑣耗時，不能滿足實際監(jiān)測中高效低成本的需要。而現(xiàn)存汞離子傳感技術(shù)還在起步階段，開發(fā)出更靈敏、更簡單快捷的汞離子的檢測技術(shù)依舊是擺在人們面前的一大挑戰(zhàn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種檢測汞離子的電化學傳感器，本發(fā)明利用“t-hg²⁺-t”的復合結(jié)構(gòu)實現(xiàn)了對目標物汞離子的高特異性檢測，利用核酸外切酶三對dna雙鏈3'端的切割作用，實現(xiàn)了目標物的循環(huán)利用，另外采用滾環(huán)復制放大技術(shù)，起到了信號放大，并利用亞甲基藍的氧化還原特性構(gòu)建了電化學生物傳感器。本發(fā)明對“t-hg²⁺-t”的復合結(jié)構(gòu)和rca進行結(jié)合應(yīng)用，使信號檢測更為靈敏和快速，使得制備的生物傳感器具有操作簡單、快速、靈敏度高等特點。

本發(fā)明一共用了3條dna鏈：

captureprobe:5′-cctccctgtccgatcctcaaag-(ch2)6-thiol-3′（seqidno.1）；

padlock:5′-ctgtccgatcctcttccttgaaacttcttcctttctttcggctgtcctcc-3′(seqidno.2)；

hap:5′-ctttgaggatcggacagggaggacagcccgatcctctttg-3′(seqidno.3)。

其中發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列中，未雜交的兩端可以與目標物特異性的識別并緊密結(jié)合形成t-hg2+-t穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。由于該鏈兩端的堿基是完全互補的，因此可以雜交形成穩(wěn)定的發(fā)夾形二級結(jié)構(gòu)。

captureprobe的3’端修飾有巰基（-sh），可以與金電極形成穩(wěn)定的au-s鍵，從而將captureprobe固定在電極表面。

padlock的5’端修飾有磷酸基團，它可以在t4連接酶的作用下形成環(huán)狀物，進而與引物雜交進行rca擴增。

本發(fā)明中用到了三種酶：phi29dna聚合酶和核酸外切酶三以及t4連接酶。phi29dna聚合酶同時具有鏈延伸和置換功能，核酸外切酶三可以對dna雙鏈的3'端的平末端進行切割，t4連接酶可以將掛鎖探針連接成環(huán)狀結(jié)構(gòu)進行滾環(huán)復制放大。

本發(fā)明中二價汞離子的檢測傳感器制備是在均相溶液中實現(xiàn)的，通過目標循環(huán)放大及滾環(huán)擴增方式來實現(xiàn)信號的放大，從而實現(xiàn)汞離子的高靈敏檢測，并獲得較低的檢測下限。

均相中發(fā)生的反應(yīng)主要有：發(fā)夾結(jié)構(gòu)的dna在有目標物存在的情況下，能夠形成穩(wěn)定的“t-hg²⁺-t”的復合結(jié)構(gòu)。此時均相中的外切酶三就可以水解dna雙鏈3'端，使目標物成游離的狀態(tài)，并可進一步結(jié)合其他的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)第一次循環(huán)放大，即目標物的循環(huán)利用。釋放出的單鏈作為二級目標物與掛鎖探針雜交，在t4連接酶作用下，掛鎖探針形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，此時在phi29dna聚合酶與dntp的共同作用下，以掛鎖探針為模板、以二級目標物為引物發(fā)生鏈延長，實現(xiàn)第二次循環(huán)放大。

在均相反應(yīng)中，兩步放大的反應(yīng)條件均為37℃，反應(yīng)時間是2h。

具體技術(shù)方案如下：

1）金電極首先在0.3μm和0.05μm的氧化鋁漿中進行拋光處理，直到呈鏡面，用pbs和二次水反復沖洗；

2）將10μl的10μm的captureprobe滴加到電極表面，在室溫下孵育2h；通過au-s鍵將巰基鏈固定到電極表面；

3）均相反應(yīng)中的主要步驟：

a、將滅菌水，10x的緩沖液buffer，2μl外切酶三、2μl濃度為1μm的hap和2μl目標物加入到預(yù)先準備好的滅菌的離心管中；震蕩30s，然后將混勻的混合液放入30℃的恒溫箱中孵育50min；

b、繼續(xù)向a步的離心管中加入2μl10μmpadlock，1μlt4鏈接酶，2μlphi29聚合酶和2μldntp；震蕩30s，然后將混勻的混合液繼續(xù)放入37℃的恒溫箱中孵育1h；

c、將b步反應(yīng)后的溶液滴加到預(yù)先修飾好captureprobe的電極上;然后將電極繼續(xù)放在37℃的恒溫箱中孵育1h；

d、用磁力攪拌器在pbs溶液中清洗電極，每次10min，共清洗3次；

e、將清洗好的電極浸泡在8×10^-5m的亞甲基藍溶液中10min；

f、用磁力攪拌器在pbs溶液中清洗電極，每次10min，共清洗3次。

該發(fā)明的檢測方式是電化學檢測，利用傳統(tǒng)的三電極體系。ag/agcl為參比電極，鉑絲為對電極，修飾的金電極為工作電極。在檢測之前，先通過au-s鍵將captureprobe固定到電極表面。然后將反應(yīng)后的均相溶液修飾到電極表面，在37℃孵育2h使均相中的rca產(chǎn)物與電極表面的captureprobe完成雜交反應(yīng)，從而使rca產(chǎn)物固定到電極表面。然后將電極浸泡在亞甲基藍溶液中10分鐘，用三電極工作體系檢測mb的氧化還原峰。

本發(fā)明具有如下的技術(shù)效果：

1、利用“t-hg2+-t”的復合結(jié)構(gòu)實現(xiàn)了對目標物汞離子的高特異性檢測；

2、利用核酸外切酶三對dna雙鏈3'端的平末端的水解作用，實現(xiàn)了目標物的循環(huán)利用，起到了信號放大的作用；

3、利用rca滾環(huán)放大技術(shù)實現(xiàn)了第二步循環(huán)放大。信號的兩次循環(huán)放大實現(xiàn)了對目標物的高靈敏檢測，提高了檢測的靈敏度；

4、該傳感器的反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)速度快。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的反應(yīng)原理圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。

實施例1

1）金電極首先在0.3μm和0.05μm的氧化鋁漿中進行拋光處理，直到呈鏡面，用pbs和二次水反復沖洗；

2）將10μl的10μm的captureprobe滴加到電極表面，在室溫下孵育2h；通過au-s鍵將巰基鏈固定到電極表面；

3）均相反應(yīng)中的主要步驟：

a、將滅菌水，10x的緩沖液buffer，2μl外切酶三、2μl濃度為1μm的hap和2μl目標物（濃度分別為500nm,200nm，100nm，1nm，500pm，100pm）加入到預(yù)先準備好的滅菌的離心管中；震蕩30s，然后將混勻的混合液放入30℃的恒溫箱中孵育50min；

b、繼續(xù)向a步的離心管中加入2μl10μmpadlock，1μlt4鏈接酶，2μlphi29聚合酶和2μldntp；震蕩30s，然后將混勻的混合液繼續(xù)放入37℃的恒溫箱中孵育1h；

c、將b步反應(yīng)后的溶液滴加到預(yù)先修飾好captureprobe的電極上;然后將電極繼續(xù)放在37℃的恒溫箱中孵育1h；

d、用磁力攪拌器在pbs溶液中清洗電極，每次10min，共清洗3次；

e、將清洗好的電極浸泡在8×10^-5m的亞甲基藍溶液中10min；

f、用磁力攪拌器在pbs溶液中清洗電極，每次10min，共清洗3次；

g、以ag/agcl為參比電極，以pt電極為對電極，電位設(shè)置為0到-0.5v，脈沖寬度0.05v，掃描速率為0.06s，采用差分脈沖伏安技術(shù)讀取mb電信號的變化，檢測目標物。具體原理圖如附圖1。

上述過程中用到的溶液：

1、pbs緩沖液是由方法配制：na2hpo4(10mm)，nah2po4(10mm),nacl(140mm),kcl(1mm),mgcl2(1mm),cacl2(1mm),最終溶液的ph值為7.4。

2、10x的緩沖液（buffer）是隨外切酶一起買來的，可直接使用。

3、配置的pbs緩沖液與超純水均需進行高溫滅菌處理。具體方法是，將pbs和超純水分別放置在不同的錐形瓶中，然后用錫箔紙和報紙進行封口。在高壓滅菌鍋中在120℃的溫度下滅菌20min。

本發(fā)明提供的傳感器，在濃度為500nm,200nm，100nm，1nm，500pm，100pm的范圍內(nèi)檢測結(jié)果呈線性分布，也就是，在這一檢測濃度范圍內(nèi)，其檢測結(jié)果是準確，穩(wěn)定的。

<110>濟南大學

<120>一種檢測汞離子的電化學傳感器

<160>2

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<212>dna

<213>人工序列

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<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>引物

<400>1

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<212>dna

<213>人工序列

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